Desenvolvimento de sistemas de análise da função gênica para fungos entomopatogênicos : construção de linhagem ΔKu70 em Metarhizium anisopliae

• Autor(a) principal: Czeczot, Alexia de Matos
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/150590
• topic: Metarhizium anisopliae; Fungo entomopatogenico

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um organismo-modelo para o estudo das interações patógenos-hospedeiros. A caracterização da função gênica pela construção de mutantes nulos é uma das abordagens mais utilizadas para caracterizar a infecção, realizada a partir da interrupção do locus de interesse via recombinação homóloga. No entanto, a geração de mutantes nulos por recombinação homóloga exibe baixa eficiência em fungos filamentosos uma vez que a recombinação não homóloga é a principal via de reparo. Entre as proteínas envolvidas neste processo estão o heterodímero Ku, proteína quinase dependente de DNA e o complexo ligase IV-Xrcc4. Sabe-se que mutantes na via de recombinação não homóloga aumentam a frequência de recombinação homóloga. Portanto, o objetivo deste trabalho é obter mutantes para o gene ku70, a fim de aumentar a taxa de recombinação homóloga para que, posteriormente, possam ser construídos, com maior eficiência, mutantes funcionais para genes alvo em M. anisopliae. Para isso, foi construído um cassette de deleção para o gene ku70, que foi clonado no vetor binário pPZP201BK, construindo o vetor pPZP::ΔKu70::nat. Este vetor foi utilizado na transformação de M. anisopliae mediada por Agrobacterium tumefaciens. Desta transformação, foram obtidos seis mutantes com o locus do gene ku70 interrompido. Estes mutantes foram submetidos a teste de tolerância a estressores abióticos a fim de avaliar se a sensibilidade a estes compostos foi alterada. A taxa de crescimento e morfologia foram similares às da linhagem selvagem. Além disso, para confirmar o aumento da recombinação homóloga, cinco mutantes foram utilizados na construção de um mutante nulo para o gene chimaD1. Esta análise inicial indica que a taxa de recombinação homóloga aumentou de 1 % na linhagem selvagem para aproximadamente 40 % na linhagem Δku70. A eficiência de infecção dos mutantes, avaliada por bioensaio com Ulomoides dermestoides, indicou ausência de diferença entre a linhagem selvagem e a linhagem Δku70.