Expressão de genes codificadores de versões truncadas da urease de Canavalia ensiformis em plantas

• Autor(a) principal: Picolotto, Patrícia Regina Dhein
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/117626
• topic: Plantas transgênicas; Jaburetox; Melhoramento genético vegetal; Canavalia ensiformis; Urease; Recombinant protein; Transgenic plants

A agricultura no Brasil cresce a cada ano juntamente à necessidade da produção de maiores quantidades de alimentos. Os danos causados por insetos e fungos nas plantações podem representar grandes perdas e prejuízo aos agricultores e, por isso, novas abordagens para o melhoramento destas culturas são necessárias. As ureases são enzimas níquel-dependentes que catalisam a reação de hidrólise da ureia para formar amônia e dióxido de carbono. As ureases são encontradas em plantas, fungos e bactérias, mas não em animais. A urease da semente de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco ou jack bean) possui três isoformas cujas propriedades inseticida e antifúngica, em maior ou menor grau, já foram comprovadas. Tendo em vista que insetos e fungos são os principais agentes que causam danos às culturas agrícolas, as ureases representam um grande potencial biotecnológico para o melhoramento vegetal. Pelo presente trabalho, teve-se por objetivo transformar plantas-modelo de tabaco (Nicotiana tabacum SR1) com um gene que codifica um peptídeo interno da urease de C. ensiformis, denominado Jbtx, e regenerar plantas transgênicas resistentes a determinados tipos de insetos e fungos. O plasmídeo contendo a sequência gênica codificadora de Jbtx foi transformado em células de Escherichia coli para clonagem. O plasmídeo e a sequência codificadora foram, então, confirmados por sequenciamento de DNA. Utilizando-se primers especialmente projetados, a região codificadora do peptídeo foi amplificada pela reação em cadeia da DNA-polimerase (PCR) e o fragmento foi combinado ao plasmídeo pENTR/D-TOPO (Invitrogen), obtendo-se clones recombinantes. Por meio de recombinação, de acordo com o sistema Gateway (Invitrogen), o gene Jbtx foi transferido de pENTR/D-TOPO-Jbtx para o plasmídeo binário pK7WG2D (Universidade de Ghent). Em seguida, pK7WG2D-Jbtx foi introduzido em células de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 para a transformação genética de N. tabacum SR1. Prosseguiu-se, então, com a transformação de discos foliares de tabaco, na qual se obteve brotos de plantas possivelmente transgênicos. Uma planta foi regenerada a partir dos brotos e se confirmou por PCR que ela é positiva para Jbtx.