Padronização da expressão do complexo ribonucleoprotéico sgRNA:Cas9 em Escherichia Coli e avaliação da atividade inativadora de genes alvo em fungos entomopatogênicos

• Autor(a) principal: Silva, William Tadeu Santos da
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/252473
• topic: Fungos; Metarhizium; Proteína 9 Associada à CRISPR

Considerado um organismo modelo para o estudo das interações patógeno-hospedeiro, Metarhizium anisopliae é um fungo filamentoso entomopatogênico amplamente utilizado no controle biológico de pragas. A caracterização de funções gênicas com a construção de mutantes nulos é uma das abordagens mais utilizadas para descrever os mecanismos de infecção de microrganismos. Entretanto, a geração de mutantes funcionais utilizando os métodos moleculares de geração de mutantes nulos por recombinação homóloga apresenta baixa eficiência em fungos filamentosos. Com o advento da era genômica, novas metodologias de edição de DNA vêm sendo testadas, dentre elas ganha notoriedade o sistema CRISPR, desenvolvido a partir de mecanismos moleculares do sistema imunológico bacteriano, no qual um RNA guia ligado à uma endonuclease direciona a clivagem do DNA alvo. Portanto, o presente estudo propõe avaliar a participação do gene ChiMaD4 da família das quitinases, subgrupo D, na virulência de M. anisopliae a partir da construção de mutantes nulos do fungo utilizando do sistema CRISPR/Cas9. Para isso, foram construídos cassetes de inativação do locus do gene ChiMaD4, que foi clonado no vetor binário pPZP201BK, gerando os vetores pPZP201BK::ΔChiMaD4Bar e pPZP201BK::ΔChiMaD4Sur. Utilizando polietilenoglicol, foi realizada a transfecção dos protoplastos de M. anisopliae pelo sistema CRISPR. A utilização desse sistema para a geração de mutantes nulos se mostra como uma potencial solução para o aumento das taxas de recombinação. Contudo, observamos em nossos experimentos que a regeneração dos protoplastos transformados não ocorreu provavelmente devido a adaptações nos protocolos de transfecção entre diferentes microrganismos, o que evidencia a dificuldade de implementação de novas metodologias em organismos mais complexos. Avaliando os resultados obtidos a partir desse trabalho novas tentativas de geração de mutantes funcionais serão realizadas, utilizando diferentes protocolos a fim de estabelecer uma metodologia eficaz para o uso de CRISPR/Cas em fungos filamentosos.