Metodologias para análise de amostras de leite UHT por MALDI-TOF

• Autor(a) principal: Gonçalves, Natasha Cristine
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/249837
• topic: Espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz; Leite; Amostras de alimentos; Tecnicas bacteriologicas; MALDI-TOF; Mass spectrometry; Bacterial identification; Milk; Bacteria

O MALDI-TOF MS, Espectrometria de Massa de Tempo de Voo por Ionização de Dessorção a Laser Assistida por Matriz, é uma técnica muito utilizada na Microbiologia Clínica para identificar patógenos, principalmente, em amostras de sangue, já que seu uso permite resultados de forma mais rápida, possibilitando o tratamento e diagnóstico corretos do paciente. Estudos vêm sendo feitos para expandir os tipos de amostras que possam ser analisadas pelo MALDI-TOF quanto a sua composição microbiana, como urina, líquido cefalorraquidiano e leite. Entretanto, em algumas, o MALDI-TOF ainda requer o cultivo prévio dos microrganismos para que possam então serem analisados. Para otimizar o tempo de liberação dos resultados, pesquisadores têm testado diversos protocolos de forma a identificar os patógenos diretamente das amostras, pulando a etapa de isolamento dos microrganismos em placa. Isso favorece resultados ainda mais rápidos, resultando em melhor prognóstico dos pacientes. Todavia, para amostras de leite, existem estudos sobre a identificação de microrganismos previamente isolados pelo MALDI-TOF e raros sobre identificação direta da amostra. Diante disso, o presente estudo buscou desenvolver uma metodologia para a identificação direta de microrganismos em amostras de leite UHT pelo MALDI-TOF baseada em uma metodologia de identificação direta de amostras de sangue já publicada e, também, determinar a sensibilidade diagnóstica do MALDI-TOF. Para isso, uma amostra de leite UHT foi contaminada separadamente com nove cepas bacterianas: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enteroccocus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes e Pseudomonas aeruginosa. Foram utilizadas 3 metodologias diferentes entre si. As metodologias 1 e 2 consistiram em tratar as amostras previamente com saponina a 5%, seguida de uma extração com ácido fórmico e acetonitrila, porém foi utilizado leite semidesnatado no método 1 e leite desnatado no 2. No método 3, as amostras foram tratadas previamente com saponina a 5%, seguido por extração com isopropanol a 75% e extração com etanol etílico absoluto a 75%, ácido fórmico e acetonitrila. Nenhum dos 3 métodos obtiveram resultados de identificação por MALDI-TOF, impossibilitando também, neste caso, a determinação da sensibilidade diagnóstica para esse tipo de amostras. Supõe-se que a não identificação das amostras seja devido à composição complexa do leite, contendo lipídios que não foram solubilizados e removidos pelos métodos de extração. Acredita-se também que as proteínas do leite se sobrepuseram às proteínas das bactérias, impedindo sua detecção. Resta então, desenvolver um protocolo utilizando outro reagente para remover as proteínas e lipídeos do leite para que seja possível a identificação dos microrganismos diretamente do leite pelo MALDI-TOF.