Genotipificação de Actinobacillus pleuropneumoniae através de métodos moleculares

• Autor(a) principal: Simoni, Cintia
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/80509
• topic: Bioquimica : Microorganismos; Actinobacillus pleuropneumoniae; Genótipo

O Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente da pleuropneumonia suína, doença infecto-contagiosa amplamente distribuída no rebanho suíno mundial e de importância econômica significativa, podendo afetar suínos susceptíveis de várias idades. O agente possui 15 sorotipos conhecidos, os quais podem apresentar reações cruzadas em testes diagnósticos, dificultando a sorotipificação. A determinação do sorotipo de ocorrência em um dado surto e/ou região é importante na promoção da profilaxia, mas não é a única exigência para um efetivo controle. Em razão da diversidade genética e das diferenças na virulência entre as amostras, mesmo em amostras de um mesmo sorotipo, é necessário o desenvolvimento de métodos que possam diferenciar as amostras isoladas a campo em diferentes surtos da doença. O objetivo deste trabalho é o de desenvolver e padronizar técnicas de biologia molecular, visando a genotipificação de isolados de A. pleuropneumoniae. A primeira técnica a ser padronizada foi o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), na qual foram utilizados os primers OPG-10 e OPG-19 (Operon Technologies). Entretanto, as tentativas iniciais de padronização da técnica evidenciaram que a mesma possui uma baixa reprodutibilidade. Em vários experimentos, amostras em duplicata divergiam quanto ao padrão de amplicons obtidos. A segunda foi a ERIC-PCR – técnica molecular baseada na amplificação por PCR de sequências de consenso presentes em elementos palindrômicos repetitivos (ERIC – Enterobacterial Repetitive Intragenic Consensus). O método ERIC apresentou reprodutibilidade entre amostras em duplicata e distinção efetiva dos diferentes sorotipos e amostras de campo. O padrão de amplicons gerado pela técnica também permitiu minuciosa análise filogenética das amostras isoladas de campo, na qual todas as amostras testadas puderam ser identificadas e caracterizadas individualmente, podendo ser agrupadas em subpopulações filogeneticamente relacionadas. A partir dos resultados obtidos é possível realizar estudos epidemiológicos mais detalhados do agente no nosso meio. A pesquisa alcançou seus objetivos na diferenciação dos isolados, porém, outros métodos devem ser pesquisados e padronizados para auxiliar a sorotipificação e a genotipificação do agente. Entre eles podemos citar a identificação dos genes que codificam para as toxinas Apx (Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxins) e as técnicas RFLP (restriction fragment length polymorphism) e AFLP (amplified fragment length polymorphism).