Expressão e purificação de fragmentos da Glicogênio Sintase Quinase de Rhipicephalus microplus

• Autor(a) principal: Schuler, Aline Domingues
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/26150
• topic: Rhipicephalus microplus; Glicogênio sintase quinase 3 beta; Rhipicephalus microplus; GSK; Control method

O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasita responsável por perdas econômicas importantes na pecuária bovina. A utilização de acaricidas é o método mais frequente no combate a este ectoparasita, entretanto, a pesquisa em torno do desenvolvimento de uma vacina contra este parasita é crescente, com resultados que mostram que este pode ser um método de controle eficiente. Baseados nisto, diversas proteínas envolvidas no desenvolvimento do carrapato estão sendo caracterizadas, incluindo a Glicogênio Sintase Quinase (GSK). A GSK é uma serina/treonina quinase envolvida na síntese do glicogênio, o maior estoque de glicose em células animais. Resultados prévios mostraram que o tratamento de carrapatos adultos com um inibidor específico para GSK (alsterpaullone) causa redução significante no número e na fertilidade dos ovos. Assim o estudo da GSK de R. microplus pode contribuir para o desenvolvimento de uma vacina para proteção imunológica contra o carrapato. Visando estudar essa enzima a nível molecular, o gene que codifica essa proteína foi subclonado em 2 fragmentos para a obtenção de proteínas recombinantes referentes as porções N-terminal e C-terminal da GSK. Para a clonagem, amplicons obtidos por PCR foram hidrolisados e ligados ao vetor de expressão. A clonagem foi confirmada por hidrólise, PCR e sequenciamento de DNA. Escherichia coli BL21(DE3) C41 foi transformada para a obtenção do fragmento protéico recombinante referente à porção N-terminal da proteína (N-GSKr) e E. coli BL21(DE3) RP foi transformada para a obtenção do fragmento protéico recombinante referente a porção C-terminal (C-GSKr). As condições ideais para a expressão protéica foram estipuladas a partir do teste de diferentes condições de temperatura e período de incubação das culturas. As expressões foram analisadas por eletroforese SDS-PAGE 12% e a presença das proteínas recombinantes foram confirmadas por western blot com anticorpo monoclonal anti-histidina e a purificação C-GSKr realizada por cromatografia de afinidade a Ni+2. Foi obtido um soro de coelho anti-C-GSKr, comprovando sua capacidade de induzir resposta imune. Em estudos futuros este soro será usado em western blot para identificar a presença de GSK em tecidos de carrapato.