Estudo da expressão da caveolina-1 em células estreladas hepáticas (GRX)

• Main Author: Ilha, Mariana
• Publication Date: 2012
• Format: Bachelor thesis
• Language: por
• Source: Repositório Institucional da UFRGS
• Download full: http://hdl.handle.net/10183/72352
• topic: Fibrose hepática

A fibrose hepática está entre as doenças que mais causam mortes no mundo, e é caracterizada pelo acúmulo de matriz extracelular fibrótica, cuja presença danifica as funções do fígado. As células estreladas hepáticas (HSC) participam ativamente deste processo, modificando seu fenótipo quiescente, rico em lipídios no citoplasma, para o fenótipo ativado, em resposta ao insulto hepático. A fibrose hepática pode causar uma insuficiência hepática e hipertensão portal, causando uma modificação da arquitetura hepática. A linhagem GRX é um modelo de HSC ativadas. As caveolas são pequenas invaginações que ocorrem na membrana plasmática com um tamanho entre 50-100nm. Estas estruturas possuem um formato de U ou vesículas e ocorrem em todos os tipos celulares. As caveolas são caracterizadas como microdomínios de membrana ou rafts lipídicos, que são regiões especialmente ricas em glicoesfingolipídeos, colesterol e proteínas GPI-ancoradas. As caveolas têm importantes papeis na fisiologia das células como: transcitose, endocitose, pinocitose, homeostase do colesterol, rotas de transdução de sinais, migração celular, controle do ciclo celular e polaridade celular. As principais proteínas que compõem as caveolas são da família das caveolinas, sendo a mais importante a caveolina-1 (Cav)-1, que junto com a caveola, desempenha importantes funções na célula. A Cav-1 é uma proteína estrutural de membrana presente em todos os tipos celulares, que estabiliza estes domínios de membrana, contribuindo para a manuntenção de proteínas residentes nas caveolas. Em fígados cirróticos, é encontrado um aumento da expressão da Cav-1 nas células endoteliais sinusoidais e nas HSCs, sugerindo que o aumento da expressão da Cav-1 pode estar relacionado com a hipertensão portal que acompanha o processo de fibrose. No presente trabalho, foi feita uma superexpressão da Cav-1 associada com a proteína fluorescente EGFP através do método de transfecção com o plasmídeo pCavEGFP em células GRX. Para isso, foi estabelecido um protocolo de transfecção onde obtivemos uma linhagem permanente que expressa a Cav-1 fluorescente, denominada GRX GFP-Cav. Por microscopia óptica, foi observado que as células GRXGFP-Cav apresentam uma morfologia alterada em relação às células GRX. Dados de imunoblotting comprovaram que houve aumento da expressão da Cav-1 nas GRXGFP-Cav. Experimentos de colocalização nas células transfectadas, utilizando o anticorpo para Cav-1 conjugado a um segundo anticorpo que emite fluorescência vermelha, comprovaram o sucesso da transfecção. Uma vez que esta proteína desempenha um importante papel no estado de ativação das HSC, as células transfectadas são uma excelente ferramenta para o estudo da fibrose hepática através da microscopia confocal.