Padronização da clonagem da subunidade AgB8/1 do antígeno B de Echinococcus granulosus em vetor para expressão na levedura Pichia pastoris

• Autor(a) principal: Fermino, Fernanda Zilli
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/122198
• topic: Echinococcus granulosus; Pichia pastoris; Clonagem; Echinococcus granulosus; Antígeno B; Pichia pastoris

O Echinococcus granulosus é um helminto parasita pertencente à Classe Cestoda. O desenvolvimento da fase larval (cisto hidático) de E. granulosus nas vísceras dos hospedeiros intermediários é responsável pela doença hidatidose cística. O cisto consiste em uma estrutura unilocular preenchida pelo líquido hidático, o qual contém os produtos de secreção/excreção do parasito, sendo o antígeno B (AgB) a principal proteína secretada. O AgB é uma lipoproteína oligomérica formada por subunidades de 8 kDa codificadas por uma família multigênica com pelo menos cinco genes identificados (EgAgB8/1-EgAgB8/5). O antígeno B (AgB) tem sido descrito como envolvido em diversos mecanismos da interação parasito-hospedeiro que promovem o estabelecimento e a sobrevivência do parasito no hospedeiro intermediário. A presença de grandes quantidades de AgB no líquido hidático sugere um importante papel na biologia do parasito. A levedura Pichia pastoris constitui um dos sistemas mais utilizados e bem sucedidos para a expressão heteróloga de proteínas, seja para emprego em pesquisa, seja para produção industrial. Uma grande vantagem de P. pastoris sobre sistemas de expressão bacterianos é que a levedura tem potencial para realizar muitas das modificações pós-traducionais tipicamente associadas com eucariotos superiores. Neste trabalho, foi realizada a padronização da amplificação da sequência codificadora da subunidade AgB8/1 por PCR e a preparação do vetor de expressão pPICZαC, de P. pastoris, para a clonagem. A sequência codificante de AgB8/1 foi amplificada por uma PCR primária e o produto dessa reação foi utilizado como molde para uma PCR secundária, a partir da qual se obteve um fragmento de 292 pb que, posteriormente, será utilizado para a clonagem por recombinação homóloga in vivo. A partir da obtenção do clone, serão padronizadas a expressão na levedura P. pastoris e a purificação da proteína recombinante para utilização em estudos estruturais e funcionais.