Clonagem e expressão de genes relacionados com a biossíntese de NAD e FAD de Mycoplasma hyopneumoniae

• Autor(a) principal: Cattani, Amanda Malvessi
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/250063
• topic: Mycoplasma hyopneumoniae; Clonagem; Expressão gênica

Bactérias do gênero Mycoplasma compreendem um grupo de mais de 200 espécies que se caracterizam principalmente por seu tamanho diminuto, ausência de parede celular e por serem parasitas obrigatórios de uma ampla gama de organismos incluindo humanos, plantas e animais. A espécie Mycoplasma hyopneumoniae encontra-se normalmente associada a suínos, causando uma doença respiratória denominada pneumonia enzoótica suína, que caracteriza-se por ser crônica porém não muito severa, podendo se agravar por infecções oportunistas de outras bactérias, gerando grandes perdas econômicas às indústrias suinícolas. Neste trabalho 3 genes que codificam proteínas anotadas como hipotéticas (MHP7448_0278, MHP7448_0394 e MHP7448_0476), e que revelaram a presença de motivos proteicos relacionados a atividades metabólicas, como a rota de biossíntese de FAD e NAD, respectivamente, foram selecionados, amplificados por PCR e clonados em vetores de expressão de Escherichia coli. A expressão, solubilidade e rendimento das proteínas recombinantes foram analisados. A clonagem com o gene MHP7448_0394 resultou em uma colônia recombinante. Para o gene MHP7448_0278 três colônias recombinantes foram obtidas e para o gene MHP7448_0476 a clonagem ainda não foi bem sucedida. A expressão ocorreu em linhagens de E. coli BL21 e foi induzida com a adição de IPTG. As melhores linhagens para a expressão da proteína codificada pelo gene MHP7448_0394 foram E. coli BL21 (DE3) pLysE e E. coli BL21 (DE3) Star, e para a proteína codificada pelo gene MHP7448_0278 as melhores cepas foram E. coli BL21 (DE3) pLysE e E. coli BL21 (DE3) CodonPlus Rill. O teste de solubilidade proteica foi realizado nas duas melhores linhagens de expressão de MHP7448_0394 e ambas mostraram a proteína na sua fração solúvel em condições padrões de indução, sendo então purificada a partir de cromatografia de afinidade. A proteína codificada pelo gene MHP7448_0278 mostrou-se insolúvel nas condições padrões. As proteínas purificadas terão suas estruturas analisadas e função caracterizada.