Papel funcional da tip47 na replicação do vírus dengue 2 em hepatócitos humanos

• Autor(a) principal: Ferreira, Fabiana Abdalla Pires
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRJ
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11422/19260
• topic: Vírus da Dengue; Proteína C; Gotículas lipídicas; Perilipina-5; Perilipina-3; Dengue virus; Protein C; Lipid droplets; Perilipin-5; Perilipin-3; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA

O vírus da dengue (DENV) é o causador da principal arbovirose humana que atinge inúmeras pessoas anualmente, sendo um grande problema de saúde pública no mundo. A infecção pelo DENV provoca diversas alterações no metabolismo de lipídios, sendo o acometimento hepático um dos principais sintomas associados ao desenvolvimento de casos graves da doença. Estudos anteriores revelaram que a interação entre a proteína capsídica do DENV (DENVC) e gotículas lipídicas (GL) é essencial para a replicação viral. Além disso, experimentos de microscopia de força atômica demonstraram que a Tip47 ou perilipina 3 interage com DENVC in vitro. No entanto, ainda não se sabe se Tip47 é de fato um componente essencial para a replicação do DENV nas células hospedeiras. Com o objetivo de explorar nesse sentido, silenciamos o gene da Tip47 por meio do sistema CRISPR/Cas9 em células de hepatocarcinoma humano Huh7, gerando uma sublinhagem policlonal Huh7- ΔTip47, que tem redução de cerca de 80% na expressão de Tip47, uma sublinhagem clonal cuja expressão de Tip47 é nula (Huh7-ΔTip47-E7), bem como uma sublinhagem controle Huh7-ΔScrb. Por meio de cromatografia de camada delgada (TLC), vimos que as sublinhagens Huh7-ΔTip47 e Huh7-ΔScrb não apresentam diferenças quanto ao conteúdo lipídico intracelular (triacilglicerol, ésteres de colesterol e diacilglicerol/colesterol livre) quando comparadas entre si e às células Huh7 parentais. No entanto, a sublinhagem clonal Huh7-ΔTip47-E7 parece apresentar GL menores do que as células controle, o que não foi observado nas sublinhagens policlonais. Quanto aos efeitos da infecção por DENV, vimos que a expressão de Tip47 não é alterada nas células Huh7 no tempo de 24 h.p.i. (pico de replicação do DENV nessas células, tempo adotado em todos os ensaios). A sublinhagem clonal Huh7-ΔTip47-E7, mas não a Huh7-ΔTip47-policlonal, teve menor capacidade de produzir partículas virais viáveis e reduzida porcentagem de infecção quando comparada às células controle. Quanto ao conteúdo intracelular de lipídeos, não identificamos diferenças em nenhuma das sublinhagens infectadas com mock ou DENV. Dessa forma, concluímos que Tip47 é importante para a ótima produção de DENV em células Huh7, sendo que isso não parece estar relacionado à função da Tip47 em controlar o conteúdo lipídico das GL. Além disso, a menor taxa de proliferação observada para o clone Huh7-ΔTip47-E7 parece não influenciar na menor replicação de DENV, uma vez que a infecção por outro vírus não relacionado, o MAYV, não foi afetada nessas células. Pode ser que alterações na morfologia de GL, o que parece ocorrer nas células depletadas para Tip47, influencie na menor produção de partículas virais nessas células. Uma outra possibilidade, nossa principal hipótese, é que as perilipinas (especialmente a Tip47) sejam determinantes para a localização de DENVC na superfície de GL, sendo essas nossas próximas investidas.