Reconhecimento e clivagem de proteínas de matriz extracelular por Candida haemulonii

• Autor(a) principal: Magalhães, Lucas Barros
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRJ
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11422/17729
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA; Candida; Biofilmes; Proteínas da matriz extracelular; Biofilms; Extracellular matrix proteins

O complexo Candida haemulonii compreende 3 espécies, sendo elas: Candida haemulonii, Candida duobushaemulonii e Candida haemulonii var. vulnera. Essas espécies emergiram como notórias leveduras associadas a infecções invasivas com altas taxas de falhas na terapêutica clínica. O processo de adesão às proteínas de matriz extracelular (PMEs) constitui uma etapa importante na colonização microbiana aos tecidos do hospedeiro. Essa adesão é mediada por diversas moléculas conhecidas genericamente como adesinas. Os mecanismos de adesão também são importantes para a formação de biofilme, visto que boa parte das infecções humanas está associada a essa forma de organização celular. As PMEs têm como principal função formar uma rede estrutural de suporte para as células do tecido do hospedeiro. O objetivo do presente estudo foi examinar a capacidade de reconhecimento de PMEs (laminina e fibronectina) pela espécie C. haemulonii bem como avaliar a influência dessas macromoléculas no processo de adesão e formação de biofilme, além de avaliar o papel de proteases secretadas na degradação dessas proteínas. Os resultados demonstraram que ambas as proteínas foram capazes de se ligar à superfície de diferentes isolados clínicos pertencentes à espécie C. haemulonii, como evidenciado através de citometria de fluxo. O porcentual de células fúngicas capazes de se ligar à fibronectina e laminina foi de, respectivamente, 36,5 ± 4,5 e 42,4 ± 3,6 para o isolado Ch3 (C.haemulonii) 34,8 ± 4,5 e 57,4 ± 5,7 para o isolado Ch4 (C.haemulonii); e 29,9 ± 4,5 e 48,8 ± 5,6 para o isolado Ch7 (C.haemulonii). As imagens de microscopia confocal corroboraram os dados de citometria, demonstrando a ligação das proteínas na superfície celular dos isolados fúngicos. A adesão (4 h) e a formação de biofilme (48 h) foram avaliadas na presença de fibronectina e laminina imobilizadas em uma superfície de poliestireno. A adesão inicial foi avaliada por contagem em microscópio invertido e a formação de biofilme evidenciada pelas colorações de cristal violeta e safranina (revelando biomassa e matriz polimérica extracelular, respectivamente). No resultado da adesão foi observado um aumento significativo no número de células aderidas em ambas às proteínas testadas, a saber: 48,1 ± 6,0 e 48,8 ± 5,4 fungos/campo microscópico para o isolado Ch4, respectivamente, para poliestireno recoberto com fibronectina e laminina em relação aos controles de poliestireno não revestido (28,7 ± 5,3) e poliestireno recoberto com albumina (28,4 ± 7,5). Já na formação do biofilme, não se observou nenhuma alteração significativa levando-se em consideração os dois parâmetros analisados (biomassa e matriz polimérica extracelular). A capacidade de degradação dos substratos protéicos por proteases secretadas durante a formação de biofilme foi avaliada por Western Blotting, utilizando-se anticorpos anti-fibronectina e anti-laminina. Como resultado do experimento de clivagem, foi possível observar uma degradação das duas proteínas testadas por proteases presentes no sobrenadante recuperado do biofilme fúngico. Essa degradação, por sua vez, foi analisada durante os períodos de 24, 48, 72 e 96 horas, sendo o último tempo o ápice dessa degradação. Por fim, foi avaliada a classe enzimática responsável pela degradação de PMEs por Western Blotting utilizando-se inibidores específicos para essas diferentes classes enzimáticas. Como resultado desse experimento, foi possível observar uma inibição parcial da degradação de fibronectina, principalmente pelo inibidor PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride), um inibidor clássico de serina proteases. Essas interações avaliadas, portanto, podem desempenhar um papel relevante na patogênese de fungos pertencentes ao complexo C. haemulonii.