Avaliação da atividade antimicrobiana das defensinas recombinantes de ervilha (drr230a) e café (cd1) produzidas em Pichia pastoris

• Autor(a) principal: Lacerda, Ariane Ferreira
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRN
• Texto Completo: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/20692
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA; Antifungal defensin; rDrr230a; rCD1; Pichia pastoris; Phakopsora pachyrhizi; Fusarium tucumaniae

A ineficácia de pesticidas químicos no controle de fungos fitopatogênicos na agricultura e a frequente incidência de doenças humanas causadas por bactérias resistentes a antibióticos levam à busca por compostos antimicrobianos alternativos. Neste contexto, defensinas vegetais constituem uma promissora ferramenta no controle de agentes patogênicos tanto de plantas quanto de humanos. Defensinas de plantas são peptídeos catiônicos com aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos, ricas em cisteínas e cuja estrutura tridimensional é bastante conservada entre as diferentes espécies vegetais. Estas moléculas de ação antimicrobiana representam um importante componente inato da resposta de defesa vegetal contra patógenos e são expressas em diversos tecidos da planta, como folhas, tubérculos, flores, vagens e sementes. O presente trabalho teve por finalidade a avaliação da atividade antimicrobiana de duas defensinas vegetais contra diferentes espécies de fungos fitopatogênicos e bactérias patogênicas ao homem. A defensina Drr230a, cujo gene foi isolado de ervilha (Pisum sativum) e a defensina CD1, cujo gene foi identificado no transcriptoma de café (Coffea arabica) foram subclonadas em vetor de expressão de levedura e expressas em Pichia pastoris. O gene cd1 foi subclonado em duas formas recombinantes: CD1tC, contendo uma sequência codificante para seis histidinas (6xHis) na região C-terminal do peptídeo e CD1tN, contendo sequência codificante para 6xHis na região N-terminal. No caso da defensina Drr230a, a sequência codificante para 6xHis foi inserida apenas na região N-terminal da proteína. Ensaios de atividade antimicrobiana das proteínas recombinantes purificadas rDrr230a e rCD1 contra Phakopsora pachyrhizi, agente causal da ferrugem asiática da soja, foram realizados para analisar a inibição da germinação de esporos in vitro e a severidade da doença causada pelo fungo in planta. As duas defensinas recombinantes testadas foram capazes de inibir a germinação de uredosporos de P. pachyrhizi, não havendo diferença entre a ação antimicrobiana de CD1tC e CD1tN. Ademais, rDrr230a e rCD1 reduziram drasticamente a severidade da ferrugem asiática da soja, conforme demonstrado em ensaios in planta. Apesar de rCD1 não ter sido capaz de inibir a proliferação das bactérias patogênicas humanas Staplylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae, rCD1 mostrou-se capaz de inibir o crescimento do fungo fitopatogênico Fusarium tucumaniae, causador da síndrome da morte súbita da soja. Os resultados obtidos mostram que tais defensinas vegetais são candidatas úteis para serem utilizadas em programas de engenharia genética de plantas para controlar doenças fúngicas impactantes na agricultura.