Expressão heteróloga de biossurfactantes identificados em bibliotecas metagenômicas

• Autor(a) principal: Araújo, Sinara Carla da Silva
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRN
• Texto Completo: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/19512
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA; Metagenômica; Biossurfactantes; Proteína hipotética; Degradação de hidrocarbonetos.

Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e estão presentes em toda biosfera, no entanto cerca de 1% das espécies pode ser cultivada por técnicas laboratoriais padrão. A metagenômica tornou possível o acesso direto ao genoma microbiano derivado de amostras ambientais, utilizando técnicas independentes de cultivo. A metodologia permite obter informação funcional de proteínas, assim como a identificação de potenciais produtos com interesse biotecnológico e de novos recursos biológicos industrialmente exploráveis, a exemplo novas soluções para impactos ambientais. Áreas contaminadas com petróleo são caracterizadas por um grande acúmulo de hidrocarbonetos e surfactantes são utilizados para sua biorremediação. Sendo assim, a abordagem metagenônima foi utilizada para selecionar genes envolvidos no processo de degradação e biossurfactação de hidrocarbonetos. Em um trabalho anterior, o DNA ambiental (eDNA) foi extraído de amostras de solo coletadas em duas diferentes áreas (Caatinga e rio salino) do Rio Grande do Norte (Brasil), as bibliotecas metagenômicas foram construídas e analisadas funcionalmente. Os clones capazes de degradar o óleo foram avaliados quanto à capacidade de sintetizar biossurfactante. O clone foi sequenciado e análise da sequencia revelou uma ORF com 897 pb, 298 aminoácidos e proteína de peso molecular próximo a 34 kDa. A busca por homologia no GenBank revelou similaridade com a sequência que codifica uma proteína hipotética de representantes da família Halobacteriaceae, que foram mostradas recentemente como produtoras de biossurfactantes. A presença da sequência codificante inserida e do fenótipo adquirido foram confirmadas. Primers foram desenhados e suas ORFs amplificadas por PCR. Em seguida, foram subclonadas em vetor de expressão pETDuet-1, contendo uma cauda de histidina, para expressão e posterior purificação da proteína de interesse. Os testes foram realizados para confirmação da atividade de biossurfactante e degradação de hidrocarbonetos e apresentaram resultados positivos. O ensaio de imunodetecção (western blot) com a utilização do anticorpo monoclonal Anti-His® confirmou a presença da proteína ambiental. Esse estudo foi o primeiro a relatar uma possível proteína com atividade biossurfactante obtida a partir de uma abordagem metagenômica.