Efeito do extrato de Eugenia uniflora sobre fatores de virulência e caracterização da ação antifúngica em isolados de Candida spp. oriundos da cavidade oral de receptores de transplante renal

• Autor(a) principal: Souza, Luanda Bárbara Ferreira Canário de
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRN
• Texto Completo: https://repositorio.ufrn.br/handle/123456789/45467
• topic: Candida spp.; Fatores de virulência; Eugenia uniflora; Mecanismo de ação; Sinergismo

A candidíase oral é uma importante manifestação clínica em receptores de transplante renal. Candida spp. possuem fatores de virulência que contribuem para o processo infeccioso, incluindo a capacidade de aderir a células epiteliais e de formar de biofilme em superfícies bióticas e abióticas. Devido ao limitado arsenal de antifúngicos disponíveis no mercado, as reações adversas e o surgimento de espécies resistentes, torna-se necessário encontrar novos antifúngicos que atuem em alvos alternativos, ou de forma sinérgica aos atuais antifúngicos e que possuam menor toxicidade. Nesse contexto, os produtos naturais têm ganhado importância. O extrato obtido a partir das folhas de Eugenia uniflora [acetona: água (7:3, v/v)] tem demonstrado atividade antifúngica contra Candida spp.. Portanto, este estudo objetivou avaliar o efeito do extrato de E. uniflora sobre fatores de virulência in vitro e caracterizar a ação antifúngica em isolados de Candida spp. oriundos da cavidade oral de receptores de transplante renal. O extrato de E. uniflora foi caracterizado por cromatografia líquida de alta eficiência e as cepas de Candida spp. pertencentes a um banco de microrganimos foram reativadas e utilizadas nas análises. A determinação da concentração inibitória mínima do extrato foi realizada pelo método de microdiluição em caldo, assim como ensaios de toxicidade frente a eritrócitos e células epiteliais bucais humanas (CEBH) foram realizados a partir da determinação do índice de hemólise e da contagem de 150 CEBH em microscópio óptico, respectivamente. Para os ensaios de virulência in vitro, as leveduras foram cultivadas na presença e ausência de 1000 µg/mL do extrato. A adesão foi quantificada usando o número de células de Candida spp. aderidas a 150 CEBH determinadas por microscópio óptico. A formação de biofilme foi avaliada usando duas metodologias: XTT (2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida) e o ensaio do cristal violeta, sendo analisado posteriormente por microscopia eletrônica de varredura. A hidrofobicidade da superfície celular (HSC) foi quantificada com o teste de adesão microbiana a hidrocarbonetos. Realizaou-se análise in silico para predição de atividade antifúngica dos compostos majortitarios determinados no extrato. Determinou-se a CIM quando na presença de ergosterol exógeno, bem como em ambiente osmoprotegido por sorbitol (0,8 M). A ação do extrato na parede celular foi avaliada a partir do crescimento das células tratadas com extratdo de E. uniflora em Ágar Sabouraud Dextrose (ASD) acrescido de calcofluor, vermelho congo e dodecil sulfato de sódio (SDS). Avaliou-se a perda de integridade da membrana utilizandose a marcação com o iodeto de propídio (IP). A ação combinada do extrato de E. uniflora com o Fluconazol, a Micafungina e o Ácido gálico foi determinada pelo método checkerboard e por fim foi determinada a curva de morte de Candida spp. tratadas com o extrato de E. uniflora e em combinação em função do tempo. O extrato de E. uniflora foi capaz de inibir em 50% o crescimento das células de Candida spp. e possui dois compostos majoritários: miricitrina e ácido gálico. Além disso, mostrou-se não citotóxico aos eritrócitos e CEBH. Reduziu a adesão as CEBH e HSC para as espécies de Candida analisadas, e observou-se uma capacidade reduzida estatisticamente significativa para formar biofilmes usando os dois métodos de quantificação. A análise in silico demonstrou que não há alvos moleculares que correlacionem a miricitrina à ação antifúngica do extrato de E. uniflora, já o ácido gálico demonstrou ligação a enzima CPY51 presente na célula fúngica. O extrato aumentou discretamente as CIM quando realizado o ensaio de ligação ao ergosterol. Porém, no ensaio na presença do sorbitol, os valores de CIM para o extrato foram aumentados, sugerindo-se que um dos possíveis mecanismos de ação seja atuar na parede celular fúngica. O tratamento das células de Candida com o extrato conferiu resistência frente aos perturbadores de parede celular, e houve perda de integridade da membrana celular fúngica quando as células tratadas com o extrato foram coradas com IP. O extrato de E. uniflora apresentou ação sinérgica aditiva quando combinado com o Fluconazol e a Micafungina. Entretanto, a combinação com o ácido gálico apresentou um efeito indeterminado (sem interação). A curva de morte das células tratadas com o extrato demonstrou uma diminuição na contagem do número de UFC em 48 horas e a combinação do extrato de E. uniflora com o fluconazol resultou em uma queda significativa na contagem de UFC. O extrato de E. uniflora pode de alguma forma estar perturbando a membrana celular, tendo visto a perda de integridade da membrana verificada no ensaio com marcação com IP. Entretanto, aparentemente esse processo não se dá, exclusivamente, através da ligação direta ao ergosterol, ou somente pela inibição da enzima CYP51 (14 α-demetilase), ação atribuída ao ácido gálico nas análises in silico. O extrato interage em nível de parede celular fúngica, haja visto o aumento da CIM no ensaio com o sorbitol e a discreta diminuição de crescimento para algumas cepas no ensaio com os perturbadores de parede celular. O extrato de E. uniflora mostrou-se promissor como uma plausível alternativa de terapia combinada com o fluconazol para o tratamento de candidíase oral. Entretanto, mais análises devem ser realizadas para confirmação das evidências apresentadas pelos ensaios realizados quanto ao mecanismo de ação do extrato de E. uniflora.