Compreensão de mecanismos fenotípicos e genotípicos relacionados à produção de β-lactamases do tipo AmpC em Enterobacteriaceae

• Autor(a) principal: Santiago, Gabrielli Stefaninni
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRRJ
• Texto Completo: https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9732
• topic: ESAC; conjugação; pAmpC; ponto isoelétrico; promotor de AmpC; AmpC promoter; conjugation; isoelectric point; Microbiologia

A produção de β-lactamase tipo AmpC em Enterobacteriaceae é relatada em todo o mundo e tem grande importância clínica e epidemiológica devido à restrição terapêutica, dificuldade de detecção, disseminação de AmpC plasmidiais e mutação do gene natural ocasionando multirresistência aos antimicrobianos, no caso de produtores de ESAC (AmpC de Espectro Estendido). Neste estudo, foi realizado um ensaio inicial de pesquisa da produção de AmpC considerando dois grupos de enterobactérias, suspeitamente produtoras da enzima, 18 isoladas de amostras clínicas humanas (FFUP - Portugal) e 20 de leite mastítico bovino (UFRRJ - Brasil), respectivamente. Posteriormente, 238 cepas de Escherichia coli, provenientes de fazendas leiteiras brasileiras, foram investigadas quanto à produção de AmpC segundo as metodologias fenotípicas e bioquímicas previamente desenvolvidas, além da pesquisa genotípica por PCR (ACC, AmpC universal, ampR, CIT, CMY, DHA, EBC, MOX e FOX). O sequenciamento do promotor e do gene inteiro ampC foi realizado em 12 cepas para avaliar mutações referentes à super produção da enzima e produção de ESAC. Todas as cepas de origem humana se mostraram fenotipicamente produtoras de AmpC sendo confirmadas em 72,2% delas pelo teste de inibição com ácido borônico (AB) e pI 9 em 44,5%. A técnica de PCR revelou: AmpC universal em 83,4% das cepas, CIT em 66,7%, CMY em 16,7% e DHA em 55,6%. Apesar de 61,1% destas cepas apresentarem suspeita de ampC plasmidial, apenas em 38,9% foi confirmada a presença do elemento móvel. Não foi possível observar a inibição completa pela cloxacilina nem nas doadoras nem nas receptoras. Dentre os 20 cepas de enterobactérias de origem animal, apenas uma cepa de Proteus mirabilis demonstrou características fenotípicas de produtora de AmpC cuja transferência do gene foi confirmada por conjugação. Possivelmente, as demais cepas tenham perdido o plasmídeo de resistência durante o transporte à FFUP, o que justificaria a suspeita inicial de produção da enzima. Dentre as 238 cepas de E. coli, 11,76% apresentou diminuída suscetibilidade à cefoxitina, característica de pAmpC ou super produtoras de AmpC ou ESAC. Não houve confirmação da produção de AmpC por inibição com cloxacilina, por AB nem pela determinação de MIC. Foi possível confirmar a ausência de pAmpC por PCR e também por conjugação. Frente a estes resultados, 2 cepas suspeitas de super produzirem a enzima e 4 suspeitos de produzirem ESAC foram analisadas quanto à mutações na região promotora e verificou-se que 3 cepas (2 suspeitos) possuem mutações na região promotora (-1, +58) sugerindo o mecanismo de super produção de AmpC. O sequenciamento do gene inteiro demonstrou mutações responsáveis pelas variações de aminoácidos nas regiões do Ω loop (191, 209) e R2 (298, 300, 304). Todas as cepas analisadas apresentaram variações nas regiões responsáveis pela maior flexibilidade da enzima propiciando a hidrólise de outros β-lactâmicos, como o cefepime. Desta forma, o estudo permitiu um importante levantamento de dados epidemiológicos sobre os genes de resistência em enterobacterias circulantes no hospital português estudado e detectou-se, pela primeira vez, mutações sugestivas de super produção de AmpC e produção de ESAC em E. coli provenientes de amostras circulantes no rebanho bovino brasileiro