Detecção de Anaplasma platys em cães e em carrapatos: padronização de qPCR e análise epidemiológica no Estado do Rio de Janeiro, Brasil e na região ocidental de Cuba

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Claudia Bezerra da
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRRJ
Texto Completo: https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9723
Resumo: platys, e investigar a circulação deste agente em cães na microrregião de Itaguaí, Rio de Janeiro, Brasil, e cães e carrapatos em duas províncias da ilha de Cuba, analisando aspectos epidemiológicos associados à infecção causada por esta bactéria em cães. Um novo método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) foi padronizado com alvo no gene citrato sintase (gltA) para a identificação de A. platys em cães naturalmente infectados. Os oligoiniciadores e a sonda foram desenhados para amplificar um fragmento de 84 pares de base baseado em sequências do gene gltA de A. platys disponíveis no GenBank. 186 amostras de sangue de cães da microrregião de Itaguaí, Rio de Janeiro, Brasil, foram testados pela qPCR. As mesmas amostras foram testadas pela citologia e reação em cadeia da polimerase nested (nPCR, 16S rDNA) para determinar o desempenho da qPCR frente à essas técnicas. 17,20% das amostras testadas pela qPCR foram positivas, significativamente mais do que detectado pela nPCR (13,98%). A técnica de qPCR foi mais específica que a citologia, em virtude dos resultados falsopositivos obtidos pela microscopia óptica. A prevalência de A. platys em cães da microrregião de Itaguaí foi de 14,4%. Cães com menos de seis meses, infestados por carrapatos, que possam maior tempo restrito ao ambiente doméstico e sem abrigo são fatores associados a infecção por este hemoparasito em cães na região do estudo. Durante investigação de A. platys realizada em Cuba, 100 amostras de sangue foram coletadas de cães residentes em quatro cidades localizadas nas províncias de Habana e Mayabeque. Ao inspecionar os animais, carrapatos encontrados foram coletados, identificados e criteriosamente agrupados, formando um total de 49 pools. Amostras de DNA extraídas do sangue dos cães e de carrapatos foram submetidas a nPCR (16S rDNA). Amostras positivas na nPCR foram também submetidas a PCR convencional (gene gltA), e os produtos foram sequenciados. Somente a espécie Rhipicephalus sanguineus sensu lato foi encontrada em cães cubanos, e 10,2% (n=5/49) desses carrapatos somado aos 16,0% (n=16/100) de cães foram considerados positivos para A. platys. Todas as sequências analisadas dos genes gltA e 16S rDNA, respectivamente, mostraram uma identidade de 99-100% com sequências de A. platys reportadas em outros países. A análise filogenética mostrou dois clusters definidos para o gene 16S rDNA e três clusters definidos para o gene gltA. Com base no gene gltA, a sequência de aminoácidos deduzidos demonstrou dois pontos de mutações não-sinônimas nas posições 88 e 168 comparados com sequência de referência DQ525687. Um estudo preliminar sobre os aspectos epidemiológicos associados com a infecção por A. platys demonstrou nenhuma associação estatística com as variáveis avaliadas (p > 0,05). O presente estudo além de relatar a primeira evidência de A. platys em ambos cães e carrapatos em Cuba, também apresenta pela primeira vez o desenvolvimento de um novo método de qPCR que contribui para o avanço da pesquisa envolvendo A. platys. O estudo epidemiológico realizado no Brasil permitiu identificar fatores importantes na ocorrência da anaplasmose canina, enquanto em Cuba, pode-se concluir que mais investigações são necessárias para avaliar quais os fatores decisivos na transmissão e dispersão de A. platys nesse país.
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Tese (Doutorado em Ciências veterinárias) - Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 20116.https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9723platys, e investigar a circulação deste agente em cães na microrregião de Itaguaí, Rio de Janeiro, Brasil, e cães e carrapatos em duas províncias da ilha de Cuba, analisando aspectos epidemiológicos associados à infecção causada por esta bactéria em cães. Um novo método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) foi padronizado com alvo no gene citrato sintase (gltA) para a identificação de A. platys em cães naturalmente infectados. Os oligoiniciadores e a sonda foram desenhados para amplificar um fragmento de 84 pares de base baseado em sequências do gene gltA de A. platys disponíveis no GenBank. 186 amostras de sangue de cães da microrregião de Itaguaí, Rio de Janeiro, Brasil, foram testados pela qPCR. As mesmas amostras foram testadas pela citologia e reação em cadeia da polimerase nested (nPCR, 16S rDNA) para determinar o desempenho da qPCR frente à essas técnicas. 17,20% das amostras testadas pela qPCR foram positivas, significativamente mais do que detectado pela nPCR (13,98%). A técnica de qPCR foi mais específica que a citologia, em virtude dos resultados falsopositivos obtidos pela microscopia óptica. A prevalência de A. platys em cães da microrregião de Itaguaí foi de 14,4%. Cães com menos de seis meses, infestados por carrapatos, que possam maior tempo restrito ao ambiente doméstico e sem abrigo são fatores associados a infecção por este hemoparasito em cães na região do estudo. Durante investigação de A. platys realizada em Cuba, 100 amostras de sangue foram coletadas de cães residentes em quatro cidades localizadas nas províncias de Habana e Mayabeque. Ao inspecionar os animais, carrapatos encontrados foram coletados, identificados e criteriosamente agrupados, formando um total de 49 pools. Amostras de DNA extraídas do sangue dos cães e de carrapatos foram submetidas a nPCR (16S rDNA). Amostras positivas na nPCR foram também submetidas a PCR convencional (gene gltA), e os produtos foram sequenciados. Somente a espécie Rhipicephalus sanguineus sensu lato foi encontrada em cães cubanos, e 10,2% (n=5/49) desses carrapatos somado aos 16,0% (n=16/100) de cães foram considerados positivos para A. platys. Todas as sequências analisadas dos genes gltA e 16S rDNA, respectivamente, mostraram uma identidade de 99-100% com sequências de A. platys reportadas em outros países. A análise filogenética mostrou dois clusters definidos para o gene 16S rDNA e três clusters definidos para o gene gltA. Com base no gene gltA, a sequência de aminoácidos deduzidos demonstrou dois pontos de mutações não-sinônimas nas posições 88 e 168 comparados com sequência de referência DQ525687. Um estudo preliminar sobre os aspectos epidemiológicos associados com a infecção por A. platys demonstrou nenhuma associação estatística com as variáveis avaliadas (p > 0,05). O presente estudo além de relatar a primeira evidência de A. platys em ambos cães e carrapatos em Cuba, também apresenta pela primeira vez o desenvolvimento de um novo método de qPCR que contribui para o avanço da pesquisa envolvendo A. platys. O estudo epidemiológico realizado no Brasil permitiu identificar fatores importantes na ocorrência da anaplasmose canina, enquanto em Cuba, pode-se concluir que mais investigações são necessárias para avaliar quais os fatores decisivos na transmissão e dispersão de A. platys nesse país.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superiorand investigate the circulation of this agent in dogs in the Itaguai microregion, Rio de Janeiro, Brazil, and dogs and ticks in two provinces of the island of Cuba, analyzing epidemiological aspects associated with infections caused by this bacterium in dogs. A new real-time polymerase chain reaction method (qPCR) was patterned to target the citrate synthase gene (gltA) for the identification of A. platys in naturally infected dogs. The primers and probe were designed to amplify a fragment of 84 base pairs based on gltA gene sequences of A. platys available in GenBank. 186 blood samples of dogs from Itaguai microregion, Rio de Janeiro, Brazil, were tested by qPCR. The same samples were tested by cytology and nested polymerase chain reaction (nPCR, 16S rDNA) to determine the performance of qPCR front of these techniques. 17.20% of the samples tested positive by qPCR were significantly more than that detected by nPCR (13.98%). The qPCR technique was more specific than cytology, due to false-positive results obtained by optical microscopy. The prevalence of A. platys in dogs from Itaguai microregion was 14.4%. Dogs less than six months, infested by ticks, that spend the most of the time restrict to domestic environment and without shelter are factors associated with infection by this hemoparasite in dogs in the study area. During research, A. platys held in Cuba, 100 blood samples were collected from residents dogs in four cities located in the provinces of Havana and Mayabeque. When inspecting the animals, found ticks were collected, identified and carefully grouped, forming a total of 49 pools. DNA extracted from blood samples from dogs and ticks were subjected nPCR (16S rDNA). Positive samples in nPCR were also subjected to conventional PCR (gltA gene), and the products were sequenced. Only the species Rhipicephalus sanguineus sensu lato was found in Cuban dogs and 10.2% (n=5/49) of these ticks added to 16.0% (n=16/100) dogs were considered positive for A. platys. All sequences analyzed of the gltA and 16S rDNA genes, respectively, showed a 99-100% identity with sequences from A. platys reported in other countries. Phylogenetic analysis showed two clusters defined for the 16S rDNA gene and three clusters defined for the gltA gene. Based on the gltA gene, the deduced amino acid sequence showed two points of non-synonymous mutations at positions 88 and 168 compared to the reference sequence DQ525687. A preliminary study on the epidemiological aspects associated with infection with A. platys showed no statistical association with the variables studied (p> 0.05). This study also to report the first evidence of A. platys in both dogs and ticks in Cuba also presents for the first time the development of a new qPCR method that contributes to the advancement of research involving A. platys. The epidemiological study in Brazil allowed us to identify significant factors in the occurrence of canine anaplasmosis, while in Cuba, it can be concluded that more research is needed to assess what the deciding factors in the transmission and spread of A. platys in that country.application/pdfporUniversidade Federal Rural do Rio de JaneiroPrograma de Pós-Graduação em Ciências VeterináriasUFRRJBrasilInstituto de Veterináriadogsmolecular diagnosticphylogenyAnaplasma platyscãesdiagnóstico molecularqPCRnested PCRfilogeniaRhipicephalus sanguineus sensu latoMedicina VeterináriaDetecção de Anaplasma platys em cães e em carrapatos: padronização de qPCR e análise epidemiológica no Estado do Rio de Janeiro, Brasil e na região ocidental de CubaDetection of Anaplasma platys in dogs and ticks: standardization of qPCR and epidemiological analysis in the State of Rio de Janeiro, Brazil and in western Cubainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisCapítulo I VALIENTE-ECHEVERRÍA, F.; LEÓN, U.; GUTJAHR, C.; AZÓCAR, T. 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description platys, e investigar a circulação deste agente em cães na microrregião de Itaguaí, Rio de Janeiro, Brasil, e cães e carrapatos em duas províncias da ilha de Cuba, analisando aspectos epidemiológicos associados à infecção causada por esta bactéria em cães. Um novo método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) foi padronizado com alvo no gene citrato sintase (gltA) para a identificação de A. platys em cães naturalmente infectados. Os oligoiniciadores e a sonda foram desenhados para amplificar um fragmento de 84 pares de base baseado em sequências do gene gltA de A. platys disponíveis no GenBank. 186 amostras de sangue de cães da microrregião de Itaguaí, Rio de Janeiro, Brasil, foram testados pela qPCR. As mesmas amostras foram testadas pela citologia e reação em cadeia da polimerase nested (nPCR, 16S rDNA) para determinar o desempenho da qPCR frente à essas técnicas. 17,20% das amostras testadas pela qPCR foram positivas, significativamente mais do que detectado pela nPCR (13,98%). A técnica de qPCR foi mais específica que a citologia, em virtude dos resultados falsopositivos obtidos pela microscopia óptica. A prevalência de A. platys em cães da microrregião de Itaguaí foi de 14,4%. Cães com menos de seis meses, infestados por carrapatos, que possam maior tempo restrito ao ambiente doméstico e sem abrigo são fatores associados a infecção por este hemoparasito em cães na região do estudo. Durante investigação de A. platys realizada em Cuba, 100 amostras de sangue foram coletadas de cães residentes em quatro cidades localizadas nas províncias de Habana e Mayabeque. Ao inspecionar os animais, carrapatos encontrados foram coletados, identificados e criteriosamente agrupados, formando um total de 49 pools. Amostras de DNA extraídas do sangue dos cães e de carrapatos foram submetidas a nPCR (16S rDNA). Amostras positivas na nPCR foram também submetidas a PCR convencional (gene gltA), e os produtos foram sequenciados. Somente a espécie Rhipicephalus sanguineus sensu lato foi encontrada em cães cubanos, e 10,2% (n=5/49) desses carrapatos somado aos 16,0% (n=16/100) de cães foram considerados positivos para A. platys. Todas as sequências analisadas dos genes gltA e 16S rDNA, respectivamente, mostraram uma identidade de 99-100% com sequências de A. platys reportadas em outros países. A análise filogenética mostrou dois clusters definidos para o gene 16S rDNA e três clusters definidos para o gene gltA. Com base no gene gltA, a sequência de aminoácidos deduzidos demonstrou dois pontos de mutações não-sinônimas nas posições 88 e 168 comparados com sequência de referência DQ525687. Um estudo preliminar sobre os aspectos epidemiológicos associados com a infecção por A. platys demonstrou nenhuma associação estatística com as variáveis avaliadas (p > 0,05). O presente estudo além de relatar a primeira evidência de A. platys em ambos cães e carrapatos em Cuba, também apresenta pela primeira vez o desenvolvimento de um novo método de qPCR que contribui para o avanço da pesquisa envolvendo A. platys. O estudo epidemiológico realizado no Brasil permitiu identificar fatores importantes na ocorrência da anaplasmose canina, enquanto em Cuba, pode-se concluir que mais investigações são necessárias para avaliar quais os fatores decisivos na transmissão e dispersão de A. platys nesse país.
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