Caracterização molecular de Ehrlichia canis (Donatien e Lestoquard, 1935) em cães do estado do Rio de Janeiro

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Renata Lins da
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRRJ
Texto Completo: https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9793
Resumo: Os objetivos do presente estudo foram de caracterizar molecularmente Ehrlichia canis, utilizando os genes de glicoproteínas de membrana (gp19, gp36, p28) e o gene Fator de Alongamento termo instável (tuf) para caracterização gênica juntamente com o gene 16S rDNA das amostras de sangue de cães naturalmente infectados, bem como avaliar a distribuição de E. canis e fatores associados em cães oriundos das mesorregiões do estado do Rio de Janeiro. Foram testadas 267 amostras de sangue de cães do estado do Rio de Janeiro, pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) com alvo em um fragmento de 93 pares de base (pb) do gene 16S rDNA para a detecção de E. canis. Para realização da caracterização molecular, as amostras positivas nesta primeira análise foram testadas por PCRs convencionais para os genes gp19 (414 pb), gp36 (814 pb) e p28 (840 pb). Uma amostra de cada mesorregião amplificada para os genes gp19, gp36 e p28 foram purificadas e sequenciadas, utilizando-se o método Sanger. Antes de avaliar a diversidade genética de E. canis, as amostras foram submetidas à detecção molecular por 16S rDNA-qPCR. Foram coletadas 267 amostras de sangue de cães do estado do Rio de Janeiro. Entre as amostras analisadas, 42,3% (n = 113/267) foram positivas para qPCR para o gene 16S rDNA de E. canis. O valor médio de Cq observado nas amostras positivas foi de 34,1 ± 5,1, variando entre 18 e 40 ciclos. O limite de detecção do qPCR foi de 10 cópias do plasmídeo por μL contendo um gene 16S rDNA de E. canis. O coeficiente de determinação das sete diluições testadas na curva padrão foi de 99,9% e eficiência de 95,7%. Ao realizar PCR para os genes gp19 e gp36, 100% (n=113/113) e 5,3% (n=6/113) das amostras foram positivas, respectivamente. As seis amostras positivas para PCR para o gene 16S rDNA também amplificaram o gene p28. Apenas uma amostra PCR positiva para os três genes (gp19, gp36 e p28) em cada uma das seis mesorregiões foi selecionada e submetida à análise de sequências de aminoácidos e nucleotídeos. A freqüência em cada mesorregião para os 113 animais positivos para E. canis, pelo gene 16S rDNA, foi de 59,29% (n=67/113) para mesorregião Metropolitana, 13,27% (n =15/113) para região Sul Fluminense, 15,04% (n=17/113) para mesorregião Norte Fluminense, 5,3% (n= 6/113) para mesorregião Centro Fluminense, 4,42% (n=5/113) na mesorregião Noroeste Fluminense e 2,65% (n= 3/113) na Baixada Litorânea. A caracterização baseada no gene gp19 demonstrou que este gene é altamente conservado e as amostras apresentaram 100% de similaridade com as sequências brasileiros e mundiais disponíveis no GenBank. Utilizando o gene gp36, foi possível observar que há pontos polimórficos entre as sequências. Na análise de agrupamentos nota-se a formação de 3 clados, as sequências do presente estudo alocaram-se no genogrupo dos Estados Unidos, sugerindo similaridade genética entre as sequências brasileiras e norte-americanas. Na análise de proteínas, todas as amostras apresentaram sequências repetidas (“Tandem Repeat Sequence”), com 11 repetições. Foram observados sete sítios de aminoácidos de alta entropia, com variações de Hx: 0,5 a 0,67 gerando uma média de entropia de 0,6 detectados ao longo de TRP36, o que sugere um alto grau de polimorfismo. A razão das mutações não-silenciosas sobre as silenciosas, utilizando ambos genes mostrou diferenças genéticas significativas (p<0,05) entre as sequências do presente estudo demonstrando que há pressão de seleção positiva em ambos os genes analisados. As sequências E. canis-BaixLit e E. canis-Met apresentaram identidade de 100% e 99% para os genes tuf e 16S rDNA quando comparados a sequência de referência Jake- EUA (CP000107) e Oklahoma- EUA (M73221), respectivamente. Tanto a análise do gene 16S rDNA como no gene tuf, foi observado a formação de dois Clados bem definidos, sendo o Clado A formado por amostras de E. canis e outras espécies do gênero Ehrlichia e o Clado B com outros organismos do gênero Anaplasma, com distância de 0,09 para o gene 16S rDNA e 0,39 para o gene tuf, demonstrando a importância do gene 16S rDNA na avaliação entre gêneros distintos. Foi observado que, a partir do diagnóstico citológico e do diagnóstico molecular (gene gp19) realizado no total de 267 amostras, 54,68% (n=146/267) apresentaram inclusões basofílicas sugestivas de parasitismo, e 43,80% (n=117/267) ocorreram amplificação de 414 pb do gene gp19, demonstrando discordância entre as técnicas (p=0,0004). Dentre os 117 animais em que foi detectado o DNA de E. canis, sendo o maior percentual (60,68%; n=71/117) nos cães da Mesorregião Metropolitana. A raça e sexo dos cães não apresentaram associação (p>0,05) com a positividade de Ehrlichia canis nas sequências analisadas. A investigação de diferenças gênicas nos isolados de E. canis torna-se útil para o entendimento e conhecimento da relação parasito-hospedeiro; além disso determinar a distribuição desta bactéria nos municípios avaliados torna-se vantajoso para a atualização da cadeia epidemiológica da erliquiose canina.
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(Doutorado em Ciências Veterinárias) - Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica - RJ, 2018.https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9793Os objetivos do presente estudo foram de caracterizar molecularmente Ehrlichia canis, utilizando os genes de glicoproteínas de membrana (gp19, gp36, p28) e o gene Fator de Alongamento termo instável (tuf) para caracterização gênica juntamente com o gene 16S rDNA das amostras de sangue de cães naturalmente infectados, bem como avaliar a distribuição de E. canis e fatores associados em cães oriundos das mesorregiões do estado do Rio de Janeiro. Foram testadas 267 amostras de sangue de cães do estado do Rio de Janeiro, pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) com alvo em um fragmento de 93 pares de base (pb) do gene 16S rDNA para a detecção de E. canis. Para realização da caracterização molecular, as amostras positivas nesta primeira análise foram testadas por PCRs convencionais para os genes gp19 (414 pb), gp36 (814 pb) e p28 (840 pb). Uma amostra de cada mesorregião amplificada para os genes gp19, gp36 e p28 foram purificadas e sequenciadas, utilizando-se o método Sanger. Antes de avaliar a diversidade genética de E. canis, as amostras foram submetidas à detecção molecular por 16S rDNA-qPCR. Foram coletadas 267 amostras de sangue de cães do estado do Rio de Janeiro. Entre as amostras analisadas, 42,3% (n = 113/267) foram positivas para qPCR para o gene 16S rDNA de E. canis. O valor médio de Cq observado nas amostras positivas foi de 34,1 ± 5,1, variando entre 18 e 40 ciclos. O limite de detecção do qPCR foi de 10 cópias do plasmídeo por μL contendo um gene 16S rDNA de E. canis. O coeficiente de determinação das sete diluições testadas na curva padrão foi de 99,9% e eficiência de 95,7%. Ao realizar PCR para os genes gp19 e gp36, 100% (n=113/113) e 5,3% (n=6/113) das amostras foram positivas, respectivamente. As seis amostras positivas para PCR para o gene 16S rDNA também amplificaram o gene p28. Apenas uma amostra PCR positiva para os três genes (gp19, gp36 e p28) em cada uma das seis mesorregiões foi selecionada e submetida à análise de sequências de aminoácidos e nucleotídeos. A freqüência em cada mesorregião para os 113 animais positivos para E. canis, pelo gene 16S rDNA, foi de 59,29% (n=67/113) para mesorregião Metropolitana, 13,27% (n =15/113) para região Sul Fluminense, 15,04% (n=17/113) para mesorregião Norte Fluminense, 5,3% (n= 6/113) para mesorregião Centro Fluminense, 4,42% (n=5/113) na mesorregião Noroeste Fluminense e 2,65% (n= 3/113) na Baixada Litorânea. A caracterização baseada no gene gp19 demonstrou que este gene é altamente conservado e as amostras apresentaram 100% de similaridade com as sequências brasileiros e mundiais disponíveis no GenBank. Utilizando o gene gp36, foi possível observar que há pontos polimórficos entre as sequências. Na análise de agrupamentos nota-se a formação de 3 clados, as sequências do presente estudo alocaram-se no genogrupo dos Estados Unidos, sugerindo similaridade genética entre as sequências brasileiras e norte-americanas. Na análise de proteínas, todas as amostras apresentaram sequências repetidas (“Tandem Repeat Sequence”), com 11 repetições. Foram observados sete sítios de aminoácidos de alta entropia, com variações de Hx: 0,5 a 0,67 gerando uma média de entropia de 0,6 detectados ao longo de TRP36, o que sugere um alto grau de polimorfismo. A razão das mutações não-silenciosas sobre as silenciosas, utilizando ambos genes mostrou diferenças genéticas significativas (p<0,05) entre as sequências do presente estudo demonstrando que há pressão de seleção positiva em ambos os genes analisados. As sequências E. canis-BaixLit e E. canis-Met apresentaram identidade de 100% e 99% para os genes tuf e 16S rDNA quando comparados a sequência de referência Jake- EUA (CP000107) e Oklahoma- EUA (M73221), respectivamente. Tanto a análise do gene 16S rDNA como no gene tuf, foi observado a formação de dois Clados bem definidos, sendo o Clado A formado por amostras de E. canis e outras espécies do gênero Ehrlichia e o Clado B com outros organismos do gênero Anaplasma, com distância de 0,09 para o gene 16S rDNA e 0,39 para o gene tuf, demonstrando a importância do gene 16S rDNA na avaliação entre gêneros distintos. Foi observado que, a partir do diagnóstico citológico e do diagnóstico molecular (gene gp19) realizado no total de 267 amostras, 54,68% (n=146/267) apresentaram inclusões basofílicas sugestivas de parasitismo, e 43,80% (n=117/267) ocorreram amplificação de 414 pb do gene gp19, demonstrando discordância entre as técnicas (p=0,0004). Dentre os 117 animais em que foi detectado o DNA de E. canis, sendo o maior percentual (60,68%; n=71/117) nos cães da Mesorregião Metropolitana. A raça e sexo dos cães não apresentaram associação (p>0,05) com a positividade de Ehrlichia canis nas sequências analisadas. A investigação de diferenças gênicas nos isolados de E. canis torna-se útil para o entendimento e conhecimento da relação parasito-hospedeiro; além disso determinar a distribuição desta bactéria nos municípios avaliados torna-se vantajoso para a atualização da cadeia epidemiológica da erliquiose canina.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)The aim of the present study was to characterize molecularly Ehrlichia canis using the membrane glycoprotein genes involved in the host parasite interaction (gp19, gp36, and p28), and also, the thermo unstable elongation factor (tuf) gene for characterization together with the 16S rDNA gene from dog blood samples, as well as to evaluate the distribution of E. canis in dogs from the mesoregions of Rio de Janeiro state. 267 blood samples from dogs from the state of Rio de Janeiro were obtained and tested by the Real-Time PCR (qPCR) targeting a fragment of 93 base pairs (bp) of 16S rDNA gene as a screening method for detection of the positive samples. Before evaluating the genetic diversity of E. canis, the samples were submitted to the molecular detection by 16S rDNA-qPCR. A total of 267 blood samples of dogs from the state of Rio de Janeiro were collected. Among the samples analyzed, 42.3% (n=113/267) were qPCR positive for 16S rDNA gene of E. canis. The average value of Cq observed in positive samples was 34,1 ± 5,1, ranging between 18 to 40 cycles. The detection limit of the qPCR was 10 copies of the plasmid per μL containing a 16S rDNA gene from E. canis. The determination coefficient of the seven dilutions tested in the standard curve was 99.9% and efficiency de 95.7%. When performing gp19-PCR and gp36-PCR, 100% (n=113/113) and 5.3% (n=6/113) of the samples were positive, respectively. The six PCR positive samples for the 16S rDNA gene also amplified the p28 gene. Only one PCR positive sample for the three genes (gp19, gp36 and p28) in each of the six mesoregions were selected and subjected to analysis of amino acid and nucleotide sequences. The frequency in each mesoregion for the 113 animals positive for E. canis, by the 16S rDNA gene, was 59,29% (n=67/113) belonged to Metropolitan mesoregion, 13.27% (n=15/113) to South Fluminense, 15.04% (n=17/113) to Northern Fluminense, 5.3% (n=6/113) Center Fluminense, 4.42% (n=5/113) to Northwest Fluminense and 2.65% (n=3/113) to Coastal Baixada. The characterization based on the gp19 gene demonstrated that this gene is highly conserved and the samples showed 100% similarity with the Brazilian and worldwide isolates available in GenBank. Using the gp36 gene, it was possible to observe that there are polymorphic points between the sequences. Cluster analysis shows the formation of 3 clades, the sequences of the present study were allocated to the genogroup of the United States, suggesting a genetic similarity between the Brazilian and North American strains. In the protein analysis, all the samples presented repeated sequences (Tandem Repeat Sequences), with 11 replicates. Seven high entropy amino acid sites were observed, with variations of Hx: 0.5 to 0.67 generating mean entropy of 0.6 detected along the TRP36, suggesting a high degree of polymorphism. The ratio of non-silent to silent mutations using both genes showed significant genetic differences (p <0.05) among the isolates of the present study demonstrating that there was positive selection pressure in both genes analyzed. The molecular detection based on the tuf gene revealed that both samples from the Metropolitan and the Baixada Litorânea mesoregions that presented adequate amplification. In the optimization of the reaction we observed a detection limit of 100 copies for the tuf gene. In the molecular characterization, E. canis-BaixLit and E. canis-Met presented 100% and 99% identity for the tuf and 16S rDNA genes when compared to the reference sequence Jake (CP000107) and Oklahoma (M73221), respectively. In the analysis of the tuf and 16S rDNA genes, the Baixada Coastal sample presented 99% identity. Non-synonymy mutation reflected in the substitution of a Glutamic Acid (E) for a Lysine (K). In the 16S rDNA and tuf genes analysis, we observed the formation of two well defined clades, where the A containing samples of Ehrlichia genus, and the B with other organisms of the genus Anaplasma suggesting genetic distance (0,34 tuf gene and 0,09 to 16S rDNA). To evaluate the distribution of E. canis in the mesoregions of Rio de Janeiro state, the cytological and molecular diagnosis was performed targeting the gp19 gene. From 267 samples, 54.68% (n=146/267) presented basophilic inclusions in monocytes suggestive of parasitism in the cytological evaluation. In 43.80% of the analyzed samples (n=117/267) it was possible to observe the amplification for gp19 gene, which demonstrated a disagreement between cytological and molecular technique results (p=0.0004). Among the 117 animals in which E. canis DNA was detected, 60.68% (n=71/117) belonged to Metropolitan mesoregion, 12.82% (n=15/117) to Fluminense South, 14.52% (n=17/117) to Northern Fluminense, 5.12% (n=6/117) Fluminense Center, 4.27% (n=5/117) to Fluminense Northwest and 2.56% (n=3/117) to Coastal Baixada. It was observed that race and gender had no association (p>0.05) with E. canis positivity. The investigation of gene differences in the isolates of E. canis becomes useful for understanding the parasite-host relationship; in addition, determining the distribution of this bacterium in the evaluated municipalities is advantageous for the updating of the epidemiological chain of canine ehrlichiosis.application/pdfporUniversidade Federal Rural do Rio de JaneiroPrograma de Pós-Graduação em Ciências VeterináriasUFRRJBrasilInstituto de VeterináriaErliquiose caninaMarcador molecularFilogeniaAspectos epidemiológicosCanine ehrlichiosisMolecular markerPhylogenyEpidemiologic aspectsMedicina VeterináriaParasitologiaMicrobiologiaCaracterização molecular de Ehrlichia canis (Donatien e Lestoquard, 1935) em cães do estado do Rio de JaneiroMolecular characterization of Ehrlichia canis (Donatien and Lestoquard, 1935) in dogs from the state of Rio de Janeiroinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesishttps://tede.ufrrj.br/retrieve/66533/2018%20-%20Renata%20Lins%20da%20Costa.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/jspui/handle/jspui/4985Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2021-08-30T23:53:33Z No. of bitstreams: 1 2018 - Renata Lins da Costa.pdf: 2024444 bytes, checksum: dbd9cb0e5d394366e1c63faf2ee951d9 (MD5)Made available in DSpace on 2021-08-30T23:53:33Z (GMT). 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Costa, Renata Lins da
Erliquiose canina
Marcador molecular
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Aspectos epidemiológicos
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Epidemiologic aspects
Medicina Veterinária
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description Os objetivos do presente estudo foram de caracterizar molecularmente Ehrlichia canis, utilizando os genes de glicoproteínas de membrana (gp19, gp36, p28) e o gene Fator de Alongamento termo instável (tuf) para caracterização gênica juntamente com o gene 16S rDNA das amostras de sangue de cães naturalmente infectados, bem como avaliar a distribuição de E. canis e fatores associados em cães oriundos das mesorregiões do estado do Rio de Janeiro. Foram testadas 267 amostras de sangue de cães do estado do Rio de Janeiro, pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) com alvo em um fragmento de 93 pares de base (pb) do gene 16S rDNA para a detecção de E. canis. Para realização da caracterização molecular, as amostras positivas nesta primeira análise foram testadas por PCRs convencionais para os genes gp19 (414 pb), gp36 (814 pb) e p28 (840 pb). Uma amostra de cada mesorregião amplificada para os genes gp19, gp36 e p28 foram purificadas e sequenciadas, utilizando-se o método Sanger. Antes de avaliar a diversidade genética de E. canis, as amostras foram submetidas à detecção molecular por 16S rDNA-qPCR. Foram coletadas 267 amostras de sangue de cães do estado do Rio de Janeiro. Entre as amostras analisadas, 42,3% (n = 113/267) foram positivas para qPCR para o gene 16S rDNA de E. canis. O valor médio de Cq observado nas amostras positivas foi de 34,1 ± 5,1, variando entre 18 e 40 ciclos. O limite de detecção do qPCR foi de 10 cópias do plasmídeo por μL contendo um gene 16S rDNA de E. canis. O coeficiente de determinação das sete diluições testadas na curva padrão foi de 99,9% e eficiência de 95,7%. Ao realizar PCR para os genes gp19 e gp36, 100% (n=113/113) e 5,3% (n=6/113) das amostras foram positivas, respectivamente. As seis amostras positivas para PCR para o gene 16S rDNA também amplificaram o gene p28. Apenas uma amostra PCR positiva para os três genes (gp19, gp36 e p28) em cada uma das seis mesorregiões foi selecionada e submetida à análise de sequências de aminoácidos e nucleotídeos. A freqüência em cada mesorregião para os 113 animais positivos para E. canis, pelo gene 16S rDNA, foi de 59,29% (n=67/113) para mesorregião Metropolitana, 13,27% (n =15/113) para região Sul Fluminense, 15,04% (n=17/113) para mesorregião Norte Fluminense, 5,3% (n= 6/113) para mesorregião Centro Fluminense, 4,42% (n=5/113) na mesorregião Noroeste Fluminense e 2,65% (n= 3/113) na Baixada Litorânea. A caracterização baseada no gene gp19 demonstrou que este gene é altamente conservado e as amostras apresentaram 100% de similaridade com as sequências brasileiros e mundiais disponíveis no GenBank. Utilizando o gene gp36, foi possível observar que há pontos polimórficos entre as sequências. Na análise de agrupamentos nota-se a formação de 3 clados, as sequências do presente estudo alocaram-se no genogrupo dos Estados Unidos, sugerindo similaridade genética entre as sequências brasileiras e norte-americanas. Na análise de proteínas, todas as amostras apresentaram sequências repetidas (“Tandem Repeat Sequence”), com 11 repetições. Foram observados sete sítios de aminoácidos de alta entropia, com variações de Hx: 0,5 a 0,67 gerando uma média de entropia de 0,6 detectados ao longo de TRP36, o que sugere um alto grau de polimorfismo. A razão das mutações não-silenciosas sobre as silenciosas, utilizando ambos genes mostrou diferenças genéticas significativas (p<0,05) entre as sequências do presente estudo demonstrando que há pressão de seleção positiva em ambos os genes analisados. As sequências E. canis-BaixLit e E. canis-Met apresentaram identidade de 100% e 99% para os genes tuf e 16S rDNA quando comparados a sequência de referência Jake- EUA (CP000107) e Oklahoma- EUA (M73221), respectivamente. Tanto a análise do gene 16S rDNA como no gene tuf, foi observado a formação de dois Clados bem definidos, sendo o Clado A formado por amostras de E. canis e outras espécies do gênero Ehrlichia e o Clado B com outros organismos do gênero Anaplasma, com distância de 0,09 para o gene 16S rDNA e 0,39 para o gene tuf, demonstrando a importância do gene 16S rDNA na avaliação entre gêneros distintos. Foi observado que, a partir do diagnóstico citológico e do diagnóstico molecular (gene gp19) realizado no total de 267 amostras, 54,68% (n=146/267) apresentaram inclusões basofílicas sugestivas de parasitismo, e 43,80% (n=117/267) ocorreram amplificação de 414 pb do gene gp19, demonstrando discordância entre as técnicas (p=0,0004). Dentre os 117 animais em que foi detectado o DNA de E. canis, sendo o maior percentual (60,68%; n=71/117) nos cães da Mesorregião Metropolitana. A raça e sexo dos cães não apresentaram associação (p>0,05) com a positividade de Ehrlichia canis nas sequências analisadas. A investigação de diferenças gênicas nos isolados de E. canis torna-se útil para o entendimento e conhecimento da relação parasito-hospedeiro; além disso determinar a distribuição desta bactéria nos municípios avaliados torna-se vantajoso para a atualização da cadeia epidemiológica da erliquiose canina.
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