Proteinases larvares de Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781) (DIPTERA: CUTEREBRIDAE)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pires, Fabiano Araujo
Data de Publicação: 2007
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRRJ
Texto Completo: https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9635
Resumo: Neste trabalho foram realizados ensaios de atividade de proteinase em solução e com proteínas imobilizadas em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio copolimerizado com gelatina, para detecção e quantificação das proteinases presentes nos extratos larvares de segundo (L2) e terceiro (L3) estágios de Dermatobia hominis. Nos ensaios quantitativos, utilizou-se um painel de peptídeos sintéticos específicos para as principais classes de proteinases. Verificamos que o substrato pGlu-Phe-Leu p-nitroanilide foi hidrolisado pelo extrato total de L2 (3,0 ± 0,2 nmoles hora-1 mg de proteína-1) e L3 (7,7 ± 0,1 nmoles hora-1 mg de proteína-1) e que ambas atividades foram parcialmente inibidas pelo trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)butane, 15 % e 3 % respectivamente. Também, demonstramos que o substrato Na-p-Tosyl-L-Arg methyl ester foi hidrolisado pelos extratos totais de L2 (117 ± 24 nmoles hora-1 mg de proteína-1) e L3 (111 ± 10 nmoles hora-1 mg de proteina-1), sugerindo uma predominância da atividade esterásica nestes extratos. A atividade específica de serino-proteinases foi totalmente inibida pelo phenylmethylsulphonyl fluoride nos extratos de L3, enquanto que somente 10 % desta atividade foi inibida nos extrados de L2. Além disso, nós detectamos que o extrato total das larvas L2 (Km = 7,59) tem maior afinidade ao Na-p-Tosyl-L-Arg methyl ester do que o extrato total das larva de L3 (Km = 35,75). Os resultados do ensaio qualitativo com géis de substrato sugerem que os extratos larvares L2 e L3 expressam serino-proteinases com similares (13 kDa e 22 kDa) e distintas (50 kDa em L2 e 30 kDa em L3) massas moleculares relativas. Adicionalmente, isolamos uma atividade esterásica enriquecida do extrato total de L3 utilizando sucessivas cromatografias em colunas de Aprotinina-Agarose e DEAE-Sephacell. Com esta estratégia, detectamos somente uma banda de proteinase de 50 kDa neste extrato total. Estes resultados contribuem para a caracterização das proteinases larvares de D. hominis.
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Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) - Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica - RJ, 2007.https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9635Neste trabalho foram realizados ensaios de atividade de proteinase em solução e com proteínas imobilizadas em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio copolimerizado com gelatina, para detecção e quantificação das proteinases presentes nos extratos larvares de segundo (L2) e terceiro (L3) estágios de Dermatobia hominis. Nos ensaios quantitativos, utilizou-se um painel de peptídeos sintéticos específicos para as principais classes de proteinases. Verificamos que o substrato pGlu-Phe-Leu p-nitroanilide foi hidrolisado pelo extrato total de L2 (3,0 ± 0,2 nmoles hora-1 mg de proteína-1) e L3 (7,7 ± 0,1 nmoles hora-1 mg de proteína-1) e que ambas atividades foram parcialmente inibidas pelo trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)butane, 15 % e 3 % respectivamente. Também, demonstramos que o substrato Na-p-Tosyl-L-Arg methyl ester foi hidrolisado pelos extratos totais de L2 (117 ± 24 nmoles hora-1 mg de proteína-1) e L3 (111 ± 10 nmoles hora-1 mg de proteina-1), sugerindo uma predominância da atividade esterásica nestes extratos. A atividade específica de serino-proteinases foi totalmente inibida pelo phenylmethylsulphonyl fluoride nos extratos de L3, enquanto que somente 10 % desta atividade foi inibida nos extrados de L2. Além disso, nós detectamos que o extrato total das larvas L2 (Km = 7,59) tem maior afinidade ao Na-p-Tosyl-L-Arg methyl ester do que o extrato total das larva de L3 (Km = 35,75). Os resultados do ensaio qualitativo com géis de substrato sugerem que os extratos larvares L2 e L3 expressam serino-proteinases com similares (13 kDa e 22 kDa) e distintas (50 kDa em L2 e 30 kDa em L3) massas moleculares relativas. Adicionalmente, isolamos uma atividade esterásica enriquecida do extrato total de L3 utilizando sucessivas cromatografias em colunas de Aprotinina-Agarose e DEAE-Sephacell. Com esta estratégia, detectamos somente uma banda de proteinase de 50 kDa neste extrato total. Estes resultados contribuem para a caracterização das proteinases larvares de D. hominis.CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoWe performed a combination of proteinase assay, either in solution or immobilized in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel copolymerized with gelatin, to detect and quantify proteinases of Dermatobia hominis second (L2) and third (L3) instar larvae. In quantitative assays, we examined proteinase activity by hydrolysis of a panel of peptide bonds specific for the main proteinase classes. We verified that the pGlu-Phe-Leu p-nitroanilide substrate was hydrolyzed by crude extracts of L2 (3.0 ± 0.2 nmoles hour-1 mg of protein-1) and L3 (7.7 ± 0.1 nmoles hour-1 mg of protein-1) and that both activities were partially inhibited by transepoxysuccinyl- L-leucylamido-(4-guanidino)butane, 15 % and 3 % respectively. Also, we demonstrated that the Na-p-Tosyl-L-Arg methyl ester substrate was hydrolyzed by crude extracts of L2 (117 ± 24 nmoles hour-1 mg of protein-1) and L3 (111 ± 10 nmoles hour-1 mg of protein-1), suggesting a predominance of esterase activity in the crude larval preparation. Interestingly, the specific activity of serine-proteinases was totally inhibited by Phenylmethylsulphonyl fluoride in the L3 crude extract, while only 10 % of this enzyme class activity was inhibited in the L2 crude extract. Also, we have detected crude extract L2 (Km = 7,59) larvae have more affinity than L3 larvae (Km = 35,75) to Na-p-Tosyl-L-Arg methyl ester. The results of the qualitative assays with substrate gels suggested that L2 and L3 larvae express serine-proteinases with similar (13 kDa and 22 kDa) and distinct (50 kDa in L2 and 30 kDa in L3) relative molecular masses. Additionally, we have isolated an enriched esterase activity from L3 crude extract using successive chromatographies in Aprotinine-Agarose and DEAE-Sephacell columns. By this strategy we detected only one 50 kDa proteinase in this larvae crude extract. Finally, these findings contribute to the biochemical characterization of D. hominis L2 and L3 larvae.application/pdfporUniversidade Federal Rural do Rio de JaneiroPrograma de Pós-Graduação em Ciências VeterináriasUFRRJBrasilInstituto de VeterináriaDermatobia hominisProteinasesSerino-proteinasesMedicina VeterináriaProteinases larvares de Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781) (DIPTERA: CUTEREBRIDAE)Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781) (DIPTERA: CUTEREBRIDAE) larvae proteinasesinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesishttps://tede.ufrrj.br/retrieve/59930/2007%20-%20Fabiano%20Araujo%20Pires.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/jspui/handle/tede/815Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:24Z (GMT). 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