Avaliação da expressão dos genes OsNRT1.1 (A, B e C) e efeito do silenciamento das isoformas OsA2 e OsA7 de PM H+-ATPases na absorção de nitrogênio em arroz
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Data de Publicação: | 2015 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRRJ |
Texto Completo: | https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9067 |
Resumo: | A disponibilidade de nitrogênio (N) nos solos é geralmente baixa, o que leva a necessidade do aporte frequente de fertilizantes e a busca por variedades mais eficientes no uso de N. Dentre os parâmetros favoráveis se inclue a maior expressão das bombas de prótons de membrana plasmática e de transportadores de nitrato de alta afinidade sob cultivos com baixo N. Neste trabalho se identificou o padrão de expressão das isoformas OsNRT1.1A, OsNRT1.1B e OsNRT1.1C, prováveis ortólogos do transportador de nitrato de dupla afinidade NRT1.1 de Arabidopsis (CHL1; NPF8.9) em resposta ao NO3- e NH4+, assim como se avaliou a importância dos genes das bombas de prótons OsA2 e OsA7 para a absorção de N. Para avaliar a expressão dos genes OsNRT1.1 (A, B e C) foram conduzidos dois experimentos: um com a variedade de arroz Nipponbare e o outro com as variedades IAC-47 (melhorada) e Piauí (local). O silenciamento dos genes osa2 e osa7 foi realizado usando a técnica do microRNA artificial (amiRNA) seguida de transformação genética do arroz. O experimento para avaliar a contribuição das duas isoformas de H+-ATPases de membrana plasmática (PM H+-ATPase) para a absorção de NO3- em baixas doses foi com as variedades IAC-47 e Piauí. Nas raízes as isoformas OsNRT1.1A e OsNRT1.1B foram as mais expressas, enquanto OsNRT1.1C apresentou baixa expressão. OsNRT1.1B demonstrou alta repressão com ressuprimento de 2,0 mM de N-NO3-, nas plantas cultivadas com NH4+ e sob deficiência de N, no entanto, OsNRT1.1B foi induzido pelo tratamento constante com 2,0 mM de N-NO3-. Após a transformação do arroz com o amiRNA para silenciar OsA2 e OsA7, a análise de expressão por PCR em tempo real mostrou que entre as duas construções, para cada gene, somente uma promoveu o silenciamento do gene, sendo as linhagens com silenciamento multiplicadas em casa de vegetação. As linhagens de arroz mutantes silenciando os genes OsA2 (osa2.2, osa2.3, osa2.4), OsA7 (osa7.1, osa7.2, osa7.3) e plantas controle IRS (plantas transformadas com vetor IRS154 vazio) foram cultivadas com quatro tratamentos: sem N por três dias, suprimento constante com 0,2 mM de N-NO3-, ressuprimento com 0,2 mM de N-NO3- após três dias de privação de N e suprimento constante com 2,0 mM de N-NO3-. Os mutantes osa7 apresentaram menor crescimento vegetativo, enquanto os mutantes osa2 cresceram normalmente em comparação com o controle IRS. Ambos os mutantes apresentaram menor influxo de NO3- quando cultivados com 0,2 mM de N-NO3- constante comparados com o controle IRS, enquanto nos outros tratamentos não houve diferença no influxo de NO3-. A atividade das PM H+-ATPases foi menor nos mutantes osa7 e osa2 em relação ao controle IRS em todos os tratamentos usados. A atividade da V-H+-ATPase não apresentou mudança em ambos os mutantes (osa7 e osa2), enquanto a atividade da V-H+-PPase foi menor somente nos mutantes osa7 quando comparado ao controle IRS. Os mutantes osa2 apresentaram menor índice de Eficiência de Absorção de N, com menor acúmulo de N-total com 0,2 mM de N-NO3- constante. Os resultados obtidos demonstram que há uma contribuição diferenciada de isoformas específicas de PM H+-ATPases para o crescimento vegetativo em arroz e para a eficiência de absorção de NO3-. |
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Dentre os parâmetros favoráveis se inclue a maior expressão das bombas de prótons de membrana plasmática e de transportadores de nitrato de alta afinidade sob cultivos com baixo N. Neste trabalho se identificou o padrão de expressão das isoformas OsNRT1.1A, OsNRT1.1B e OsNRT1.1C, prováveis ortólogos do transportador de nitrato de dupla afinidade NRT1.1 de Arabidopsis (CHL1; NPF8.9) em resposta ao NO3- e NH4+, assim como se avaliou a importância dos genes das bombas de prótons OsA2 e OsA7 para a absorção de N. Para avaliar a expressão dos genes OsNRT1.1 (A, B e C) foram conduzidos dois experimentos: um com a variedade de arroz Nipponbare e o outro com as variedades IAC-47 (melhorada) e Piauí (local). O silenciamento dos genes osa2 e osa7 foi realizado usando a técnica do microRNA artificial (amiRNA) seguida de transformação genética do arroz. O experimento para avaliar a contribuição das duas isoformas de H+-ATPases de membrana plasmática (PM H+-ATPase) para a absorção de NO3- em baixas doses foi com as variedades IAC-47 e Piauí. Nas raízes as isoformas OsNRT1.1A e OsNRT1.1B foram as mais expressas, enquanto OsNRT1.1C apresentou baixa expressão. OsNRT1.1B demonstrou alta repressão com ressuprimento de 2,0 mM de N-NO3-, nas plantas cultivadas com NH4+ e sob deficiência de N, no entanto, OsNRT1.1B foi induzido pelo tratamento constante com 2,0 mM de N-NO3-. Após a transformação do arroz com o amiRNA para silenciar OsA2 e OsA7, a análise de expressão por PCR em tempo real mostrou que entre as duas construções, para cada gene, somente uma promoveu o silenciamento do gene, sendo as linhagens com silenciamento multiplicadas em casa de vegetação. As linhagens de arroz mutantes silenciando os genes OsA2 (osa2.2, osa2.3, osa2.4), OsA7 (osa7.1, osa7.2, osa7.3) e plantas controle IRS (plantas transformadas com vetor IRS154 vazio) foram cultivadas com quatro tratamentos: sem N por três dias, suprimento constante com 0,2 mM de N-NO3-, ressuprimento com 0,2 mM de N-NO3- após três dias de privação de N e suprimento constante com 2,0 mM de N-NO3-. Os mutantes osa7 apresentaram menor crescimento vegetativo, enquanto os mutantes osa2 cresceram normalmente em comparação com o controle IRS. Ambos os mutantes apresentaram menor influxo de NO3- quando cultivados com 0,2 mM de N-NO3- constante comparados com o controle IRS, enquanto nos outros tratamentos não houve diferença no influxo de NO3-. A atividade das PM H+-ATPases foi menor nos mutantes osa7 e osa2 em relação ao controle IRS em todos os tratamentos usados. 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This work aimed to identify the expression pattern of OsNRT1.1A, OsNRT1.1B and OsNRT1.1C, possible orthologs of the Arabidopsis double affinity nitrate tranporter NRT1.1 (CHL1; NPF8.9) in response to NO3- and NH4+, as well as evaluate the importance of OsA2 and OsA7 proton pumps genes to N uptake. To evaluate OsNRT1.1 (A, B and C) gene expression, two experiments were performed: the first using Nipponbare rice variety and the second using IAC-47 (improved) and Piauí (Landrace) rice varieties. The OsA2 and OsA7 gene silencing was made using the artificial micro RNA (amiRNA) followed by rice genetic transformation. The experiment to evaluate the contribution of plasma membrane H+-ATPase (PM H+-ATPase) to low NO3- levels was made using IAC-47 and Piauí rice varieties. The OsNRT1.1 gene expression analysis in the roots showed that OsNRT1.1A and OsNRT1.1B are highly expressed, while OsNRT1.1C showed low expression rate. OsNRT1.1B expression was downregulated with ressuply of 2.0 mM of NO3--N, in the plants cultivated using NH4+ and N starving plants, however, OsNRT1.1B expression was upregulated with constant supply of 2.0 mM of NO3--N. After rice genetic transformation, Real Time PCR analysis showed that only one amiRNA successfully downregulated the target, furthermore the lineages silencing the target were multiplied in greenhouse. The rice lineages downregulating OsA2 (osa2.2, osa2.3, osa2.4), OsA7 (osa7.1, osa7.2, osa7.3) and control plants (plants transformed with empty IRS) were cultivated using four treatments: three days N starvation, constant with 0.2 mM of NO3--N, ressuply with 0.2 mM of NO3--N and constant with 2.0 mM of NO3--N. The osa7 mutants shown lower growth, meanwhile osa2 growth normally compared to control plants (IRS). Both mutants shown lower NO3- uptake when grown with constant 0.2 mM of NO3--N compared to control IRS plants, meanwhile the other treatments did not show differences of NO3- uptake. The PM H+-ATPase activity was lower in the osa7 and osa2 mutants compared to IRS plants in all treatments used. The V-H+-ATPase activity did not show difference in the mutants osa7 and osa2, however, V-H+-PPase activity was slower only in the osa7 mutants compared to IRS control plants. The mutant plants osa2 showed lower N uptake Efficiency index, accumulating lower total-N when fed with 0.2 mM of NO3--N constant. The results highlight that there is differentiated contribution of specific PM H+-ATPase isoforms to rice growth and to NO3- uptake efficiency.application/pdfporUniversidade Federal Rural do Rio de JaneiroPrograma de Pós-Graduação em Agronomia - Ciência do SoloUFRRJBrasilInstituto de AgronomiaSilenciamento gênicoEficiência de absorção de NNutrição nitrogenadaGene silencingN efficiency uptakeNitrogen nutritionBioquímicaAvaliação da expressão dos genes OsNRT1.1 (A, B e C) e efeito do silenciamento das isoformas OsA2 e OsA7 de PM H+-ATPases na absorção de nitrogênio em arrozGene expression analysis of OsNRT1.1 (A, B e C) and effects of downregulation of PM H+-ATPase isoforms OsA2andOsA7 in the nitrogen uptake in riceinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesishttps://tede.ufrrj.br/retrieve/11230/2015%20-%20Marcus%20Vinicius%20Loss%20Sperandio.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/retrieve/16734/2015%20-%20Marcus%20Vinicius%20Loss%20Sperandio.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/retrieve/23056/2015%20-%20Marcus%20Vinicius%20Loss%20Sperandio.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/retrieve/29436/2015%20-%20Marcus%20Vinicius%20Loss%20Sperandio.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/retrieve/35812/2015%20-%20Marcus%20Vinicius%20Loss%20Sperandio.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/retrieve/42210/2015%20-%20Marcus%20Vinicius%20Loss%20Sperandio.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/retrieve/48590/2015%20-%20Marcus%20Vinicius%20Loss%20Sperandio.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/retrieve/55040/2015%20-%20Marcus%20Vinicius%20Loss%20Sperandio.pdf.jpghttps://tede.ufrrj.br/jspui/handle/jspui/3040Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2019-11-05T17:57:43Z No. of bitstreams: 1 2015 - Marcus Vinicius Loss Sperandio.pdf: 2382015 bytes, checksum: 474c94a478b6c54deb3404f98766611b (MD5)Made available in DSpace on 2019-11-05T17:57:43Z (GMT). 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Bioquímica |
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A disponibilidade de nitrogênio (N) nos solos é geralmente baixa, o que leva a necessidade do aporte frequente de fertilizantes e a busca por variedades mais eficientes no uso de N. Dentre os parâmetros favoráveis se inclue a maior expressão das bombas de prótons de membrana plasmática e de transportadores de nitrato de alta afinidade sob cultivos com baixo N. Neste trabalho se identificou o padrão de expressão das isoformas OsNRT1.1A, OsNRT1.1B e OsNRT1.1C, prováveis ortólogos do transportador de nitrato de dupla afinidade NRT1.1 de Arabidopsis (CHL1; NPF8.9) em resposta ao NO3- e NH4+, assim como se avaliou a importância dos genes das bombas de prótons OsA2 e OsA7 para a absorção de N. Para avaliar a expressão dos genes OsNRT1.1 (A, B e C) foram conduzidos dois experimentos: um com a variedade de arroz Nipponbare e o outro com as variedades IAC-47 (melhorada) e Piauí (local). O silenciamento dos genes osa2 e osa7 foi realizado usando a técnica do microRNA artificial (amiRNA) seguida de transformação genética do arroz. O experimento para avaliar a contribuição das duas isoformas de H+-ATPases de membrana plasmática (PM H+-ATPase) para a absorção de NO3- em baixas doses foi com as variedades IAC-47 e Piauí. Nas raízes as isoformas OsNRT1.1A e OsNRT1.1B foram as mais expressas, enquanto OsNRT1.1C apresentou baixa expressão. OsNRT1.1B demonstrou alta repressão com ressuprimento de 2,0 mM de N-NO3-, nas plantas cultivadas com NH4+ e sob deficiência de N, no entanto, OsNRT1.1B foi induzido pelo tratamento constante com 2,0 mM de N-NO3-. Após a transformação do arroz com o amiRNA para silenciar OsA2 e OsA7, a análise de expressão por PCR em tempo real mostrou que entre as duas construções, para cada gene, somente uma promoveu o silenciamento do gene, sendo as linhagens com silenciamento multiplicadas em casa de vegetação. As linhagens de arroz mutantes silenciando os genes OsA2 (osa2.2, osa2.3, osa2.4), OsA7 (osa7.1, osa7.2, osa7.3) e plantas controle IRS (plantas transformadas com vetor IRS154 vazio) foram cultivadas com quatro tratamentos: sem N por três dias, suprimento constante com 0,2 mM de N-NO3-, ressuprimento com 0,2 mM de N-NO3- após três dias de privação de N e suprimento constante com 2,0 mM de N-NO3-. Os mutantes osa7 apresentaram menor crescimento vegetativo, enquanto os mutantes osa2 cresceram normalmente em comparação com o controle IRS. Ambos os mutantes apresentaram menor influxo de NO3- quando cultivados com 0,2 mM de N-NO3- constante comparados com o controle IRS, enquanto nos outros tratamentos não houve diferença no influxo de NO3-. A atividade das PM H+-ATPases foi menor nos mutantes osa7 e osa2 em relação ao controle IRS em todos os tratamentos usados. A atividade da V-H+-ATPase não apresentou mudança em ambos os mutantes (osa7 e osa2), enquanto a atividade da V-H+-PPase foi menor somente nos mutantes osa7 quando comparado ao controle IRS. Os mutantes osa2 apresentaram menor índice de Eficiência de Absorção de N, com menor acúmulo de N-total com 0,2 mM de N-NO3- constante. Os resultados obtidos demonstram que há uma contribuição diferenciada de isoformas específicas de PM H+-ATPases para o crescimento vegetativo em arroz e para a eficiência de absorção de NO3-. |
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2015 |
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SPERANDIO, Marcus Vinícius Loss. Análise da expressão dos genes OsNRT1.1 (A, B e C) e efeito do silenciamento das isoformas OsA2 e OsA7 de PM H+-ATPases na absorção de nitrogênio em arroz. 2015. 121 f. Tese (Doutorado em Agronomia - Ciência do Solo) - Instituto de Agronomia, Departamento de Solos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 2015. |
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