Inibição de proteínas tirosina fosfatases: diferentes mecanismos de ação de um derivado de chalcona

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Souza, Ana Caroline Arruda de
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/193693
Resumo: Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2018.
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spelling Inibição de proteínas tirosina fosfatases: diferentes mecanismos de ação de um derivado de chalconaBioquímicaProteínas tirosina fosfatasesChalconaDissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2018.Proteínas tirosina fosfatases (PTPs) são uma família de enzimas essenciais para muitos processos celulares, e têm sido validadas como alvos terapêuticos para doenças humanas. Consequentemente, há uma crescente demanda por pequenas moléculas inibidoras de PTPs. A linfoide especifica tirosina fosfatase (LYP), codificada pelo gene PTPN22, tem atraído atenção como um importante fator de risco e, consequentemente, um potencial alvo de fármacos para doenças autoimunes. O objetivo deste trabalho foi investigar a capacidade inibitória de novas chalconas frente esta enzima. Escherichia coli foi utilizada para expressar a proteína recombinante, os ensaios in vitro para investigar o potencial inibitório de 23 chalconas sintéticas em LYP foram conduzidos espectrofotometricamente usando p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato. Na triagem inicial somente um composto denominado Q11 mostrou inibição em LYP superior a 50% da atividade residual na concentração de 25 µM, sendo seu valor de IC50 = 11,5 µM. Os testes de seletividade para o Q11 mostraram pouca potência e seletividade para LYP quando comparada a outras PTPs. Por esta razão, análises cinéticas e estruturais do complexo enzima-inibidor foram realizadas com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação desta única molécula em PtpA, PtpB, YopH, LYP, PTP-PEST e PTP1B. Os ensaios cinéticos para PtpA, YopH e PTP1B revelaram um modo de inibição não-competitiva, e para PtpB, LYP e PTP-PEST revelaram uma inibição competitiva com valores de Ki menores que 15 µM. Ensaios de reversibilidade mostraram um mecanismo de inibição irreversível para YopH, enquanto para as outras o mecanismo foi reversível. Além disso, ensaios de inibição em diferentes tempos de incubação mostram que o inibidor é tempo-dependente. As análises de proteólise limitada de YopH e LYP na presença ou na ausência do composto Q11 confirmaram o modo de inibição apresentado pelas cinéticas, os espectros de MS mostraram proteção do sítio ativo em LYP, e em YopH proteção em uma região diferente do sítio ativo. A análise de estabilidade térmica por CD e fluorescência demonstrou que YopH não sofre alteração na estabilidade ou mudanças estruturais na presença do inibidor (a fluorescência não apresentou deslocamento de emissão máxima ?max). Estudos de modelagem molecular estão sendo realizados para melhor compreender os mecanismos de ligação de um único composto a diferentes enzimas.Abstract : Protein tyrosine phosphatases (PTPs) are a family of enzymes essential for numerous cellular processes, and several PTPs have been validated as therapeutic targets for many human diseases. Consequently, there is an increased demand for potential PTPs small molecule inhibitors. The lymphoid tyrosine phosphatase LYP, encoded by the PTPN22 gene, has attracted attention, as an important risk factor and, consequently, a potential drug target for human autoimmune diseases. The objective of this work was to investigate the inhibitory capacity of new synthetic chalcones against this enzyme. Escherichia coli was used to express the recombinant protein, the in vitro assays to investigate the inhibitory potential of 23 synthetic chalcones in LYP were carried out spectrophotometrically using p-nitrophenyl phosphate (pNPP) as substrate. At the initial screening, only one compound showed inhibition of LYP greater than 50%, at a concentration of 25 µM, this compound named Q11 showed an IC50 value of 11.5 µM. Further, the selectivity tests showed little potency and selectivity for LYP when compared to other PTPs. For this reason, structural analyses of the enzyme-inhibitor complex were performed with the aim of better understand the mechanisms of action of this single molecule against PtpA, PtpB, YopH, LYP, PTP-PEST and PTP1B. The kinetic assays for PtpA, YopH and PTP1B revealed a non-competitive inhibition and for PtpB, LYP and PTP-PEST revealed a competitive inhibition with Ki values lower than 15 µM. Reversibility assays showed an irreversible inhibition mechanism for YopH, while for the others the mechanism was reversible. In addition, inhibition assays at different incubation times showed that the inhibitor is time-dependent. The limited proteolysis analyses of YopH and LYP in the presence or in the absence of the compound confirmed its modes of inhibition, previously shown by kinetic analysis, furthermore limited proteolysis analysis showed the protection of the active site of LYP, and for YopH protection of a region other than the active site an allosteric site. Thermal stability analysis measured by CD or intrinsic fluorescence showed that YopH does not undergo changes in stability or structural changes in the presence of the inhibitor. Molecular modeling studies are under way to better understand the mechanisms of binding of this single compound to different enzymes.Terenzi, Hernán FranciscoMenegatti, Angela Camila OrbemUniversidade Federal de Santa CatarinaSouza, Ana Caroline Arruda de2019-03-09T04:02:09Z2019-03-09T04:02:09Z2018info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis100 p.| il., gráfs., tabs.application/pdf356268https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/193693porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2019-03-09T04:02:09Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/193693Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732019-03-09T04:02:09Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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