Desenvolvimento de iniciadores e sonda espécie-específicos para quantificação por PCR em tempo real de feijão (Phaseolus vulgaris L) em alimentos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Venturelli, Gustavo Luiz
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/123231
Resumo: Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2014.
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spelling Desenvolvimento de iniciadores e sonda espécie-específicos para quantificação por PCR em tempo real de feijão (Phaseolus vulgaris L) em alimentosCiência dos alimentosFeijao comumDissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2014.A cada ano, no Brasil, o número de aprovações para eventos geneticamente modificados cresce, bem como a área plantada de culturas transgênicas. Uma vez que no Brasil a legislação exige que produtos que contenham mais de 1% de organismos geneticamente modificados (OGM) em sua composição sejam rotulados, a identificação e quantificação destes OGM se fazem necessária. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de detecção e quantificação, por PCR em tempo real, para o feijoeiro GM Embrapa 5.1 a partir de uma nova referência endógena táxon-específica para Phaseolus vulgaris, tendo como alvo uma sequência de um gene de proteína. Para isso, três genes candidatos foram selecionados e os iniciadores testados com SYBR Green. O ensaio para o gene da Arcelina não apresentou amplificação. Ambos os ensaios para o gene da Lectina e Faseolina apresentaram especificidade esperada, entretanto o da Lectina apresentou maior especificidade e eficiência. Uma sonda TaqMan foi então desenhada, para tornar o ensaio da Lectina ainda mais específico. A especificidade do ensaio LEC foi testada com 50 amostras de feijão, provenientes de dois pools genéticos, Andino e Mesoamericano e 15 amostras de controle negativo. O ensaio táxon-específico FEI, previamente desenvolvido, foi testado com 44 amostras de feijão, a fim de comparação com o ensaio LEC. As amostras de DNA de feijão apresentaram a amplificação esperada para ambos os ensaios, LEC e FEI, apresentando um Ct médio de 20,3 ± 0,73 e 26,34 ± 1,26, respectivamente. Isto sugere que o ensaio LEC possui uma especificidade maior que o ensaio FEI. A alta homogeneidade apresentada capacita o ensaio LEC a detectar variedades de feijão dos dois pools genéticos existentes. O ensaio LEC apresentou amplificação com Ct tardio (Ct > 35) para quatro amostras negativas, porém em apenas algumas reações onde foram testadas. As eficiências do método LEC foram testadas com as amostras Pérola, Pérola GM, Pontal e Pontal GM e variaram de 92% a 101% com o R2 variando entre 0,994 e 0,998. O limite de detecção para o método foi de 101 cópias de DNA genômico. Os resultados obtidos com o ensaio LEC estão dentro dos parâmetros propostos pelo European Network of GMO Laboratories (ENGL), podendo, desta forma, o ensaio ser utilizado em estudos de análise de feijão GM. Além disso, os iniciadores desenvolvidos podem ser utilizados para quantificação e detecção tanto do feijão convencional quanto do feijoeiro Embrapa 5.1 com ambos os sistemas de PCR, TaqMan e SYBR Green.<br>Abstract : Every year the number of approvals for genetically modified events grows in Brazil as well as the area of cultivated transgenic crops. Once Brazilian legislation requires the labeling on products containing > 1% of GMOs in its composition, methods for the detection and quantification of new GMOs are necessary. The aim of the present work was to develop a new real time PCR assay for the detection and quantification of the GM common bean Embrapa 5.1 using a new taxon-specific endogenous reference targeting a coding gene of Phaseolus vulgaris. Three genes encoding common bean proteins were chosen and tested using SYBR Green chemistry. The assay for the Arcelin gene did not show amplification. Both Lectin and Faseolin assays showed the expected specificity although the Lectin assay presented higher specificity and efficiency. A TaqMan probe was then designed in order to develop a more specific detection method. The specificity of LEC assay was tested for 50 common bean samples from two gene pools, Andean and Mesoamerican, and 15 negative control samples. The previously developed taxon-specific FEI assay was evaluated by testing forty-four Phaseolus vulgaris varieties in order to compare with LEC assay. These common bean DNA samples presented the expected amplification signal and the mean Ct was 20.3 ± 0.73 and 26.34 ± 1.26 for LEC and FEI assays, respectively. It suggests that LEC assay has higher specificity than FEI assay. The high homogeneity makes the LEC assay able to reliably detect common bean varieties from both gene pools. LEC assay presented amplification at late Ct (Ct value > 35) in few reactions of four negative samples. The efficiencies of LEC method were performed using non-GM Pérola, non-GM Pontal, GM Pérola and GM Pontal samples and they ranged from 92% to 101% and R2 ranged from 0.994 to 0.998. Moreover, this assay presented a limit of detection of 101 genome copies. The results showed that the LEC assay meets the requirements proposed by the ENGL and it can be used in further studies of GM common bean analyses. Furthermore, the primers and probe developed in this work are suitable for both real time PCR detection chemistries, TaqMan and SYBR Green and they are suitable to detect and quantify either GM and non-GM common bean.Arisi, Ana Carolina MaisonnaveUniversidade Federal de Santa CatarinaVenturelli, Gustavo Luiz2014-08-06T17:57:48Z2014-08-06T17:57:48Z2014info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis100 p.| il., grafs., tabs.application/pdf327001https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/123231porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2014-08-06T17:57:48Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/123231Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732014-08-06T17:57:48Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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