Construção de linhagem recombinante de Enterococcus gallinarum para expressão da proteína Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cavalcante, Rafael Bezerra
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/188986
Resumo: Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2017.
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spelling Construção de linhagem recombinante de Enterococcus gallinarum para expressão da proteína Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)FarmacologiaPancreatiteEnterococcusDissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2017.A Pancreatite Aguda é uma doença inflamatória causada pela obstrução dos ductos biliar e pancreático por cálculos biliares. Essa obstrução gera uma lesão levando à necrose pancreática que é inicialmente estéril, mas pode se tornar infectada devido à translocação de bactérias intestinais para o sítio necrótico. A utilização profilática de antibióticos ainda é comum na prática clínica apesar de não ser apoiado pelas diretrizes mais recentes para o tratamento da Pancreatite Aguda. Os antibióticos mais utilizados nesses quadros são os da classe dos Carbapenêmicos, onde os mais comuns são o Imipenem e o Meropenem. Em um modelo experimental de pancreatite aguda previamente realizado em nosso laboratório, animais tratados com Meropenem tiveram uma sobrevida menor comparado aos animais não tratados, além de apresentarem bactérias da espécie Enterococcus gallinarum no sangue. Esses microrganismos são habitantes comensais da microbiota intestinal classificados como patobiontes, ou seja, microrganismos simbióticos com potencial patogênico sob certas condições. Estudos anteriores realizados mostraram que em animais com Pancreatite Aguda o E. gallinarum foi capaz de translocar do intestino e atingir a corrente sanguínea. A hipótese é que a translocação ocorra através da parede intestinal ou do ducto biliopancreático. A alternativa para testar essa hipótese foi o desenvolvimento de uma linhagem recombinante de E. gallinarum que expresse a proteína EGFP, uma proteína que emite fluorescência verde, através de recombinação homóloga. A partir do genoma da E. gallinarum foi amplificado uma sequência de 1000 pares de bases nucleotídicas da região promotora das subunidades ß e ß da RNA polimerase que é expressa constitutivamente durante a vida do microrganismo. Foi realizada a fusão da região amplificada com o gene egfp e o novo fragmento foi inserido no plasmídeo pGEM®-T Easy, que posteriormente foi internalizado pela bactéria durante o processo de eletroporação. As colônias que receberam o plasmídeo foram selecionadas através da resistência à Ampicilina porém não foi observado a expressão da proteína EGFP. Portanto não foi possível a construção da linhagem recombinante de E. gallinarum para a expressão da proteína EGFP através da amplificação da região promotora da subunidade ß e ß da RNA polimerase.Abstract : Acute Pancreatitis is an inflammatory disease caused by obstruction of biliary and pancreatic duct by gallstones. This obstruction generates a lesion that leads to pancreatic necrosis, which is initially sterile but may become infected due to the translocation of intestinal bacteria to the necrotic site. Prophylactic use of antibiotics is still a common in clinical practice despite the lack of support from the most recent guidelines for the treatment for Acute Pancreatitis. The most used antibiotics in these cases are those of Carbapenem s class, where the most common are Imipenem and Meropenem. In an experimental model of Acute Pancreatitis previously performed in our laboratory, animals treated with Meropenem had a shorter survival compared to untreated animals, and showed bacteria from Enterococcus gallinarum specie in the blood. These microorganisms are commensal inhabitants of intestinal microbiota classified as pathobionts, that is, symbiotic microorganisms with pathogenic potential under certain conditions. Previous studies shown that in animals with Acute Pancreatitis the E. gallinarum was able to translocate from intestine and reach the bloodstream. The hypothesis is that translocation occurs through the intestinal wall or the biliopancreatic duct. The alternative to test this hypothesis was the development of recombinant lineage of E. gallinarum that express the EGFP protein, a protein that emits green fluorescence. From the genome of E. gallinarum was amplified 1000 base pair sequence of the promoter region ß and ß subunit RNA polymerase which is constitutively expressed during the life of the microorganism. Fusion of the amplified region with egfp gene was performed and the new fragment was inserted into plasmid pGEM®-T Easy, which was later internalized by the bacterium during the electroporation process. The colonies that received plasmid were selected through resistance to Ampicilin however, no expression of protein EGFP was observed. Therefore, it was not possible the development of the recombinant E. gallinarum linage for EGFP protein expression by amplifying the promoter region of the ß and ß subunit of RNA polymerase.Spiller, FernandoMazzon, Ricardo RuizUniversidade Federal de Santa CatarinaCavalcante, Rafael Bezerra2018-08-13T04:04:16Z2018-08-13T04:04:16Z2017info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis74 p.| il.application/pdf352121https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/188986porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2018-08-13T04:04:16Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/188986Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732018-08-13T04:04:16Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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