Análise do transcriptoma de isolados de Neisseria gonorrhoeae: investigação sobre o perfil de sensibilidade à ceftriaxona

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Machado, Hanalydia de Melo
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/216567
Resumo: Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2020.
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spelling Análise do transcriptoma de isolados de Neisseria gonorrhoeae: investigação sobre o perfil de sensibilidade à ceftriaxonaBiotecnologiaGonococoTranscriptomaAgentes antiinfecciososDissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2020.Neisseria gonorrhoeae (NG) é o agente etiológico da gonorreia, infecção sexualmente transmissível que afeta cerca de 78 milhões de pessoas por ano. Desde a implementação do tratamento, o gonococo desenvolveu rapidamente diversos mecanismos de resistência às múltiplas classes de antimicrobianos utilizadas para tratar a infecção. Atualmente, a ceftriaxona (CRO) é o fármaco utilizado no tratamento de primeira linha recomendado pelo Organização Mundial da Saúde, apesar de já existir casos de resistência descritos. Considerando a possibilidade da infecção gonocóccica tornar-se intratável, existe a necessidade de compreender mecanismos moleculares e fenotípicos relacionados a resistência antimicrobiana, principalmente à CRO. Neste estudo, sequenciamos alguns genes (mtrR, penA, ponA e porB) de 16 isolados com diferentes MIC para CRO e realizamos RNA-Seq para avaliar os mecanismos de resistência. Para realizar a análise do transcriptoma, um isolado clínico de NG (MIC CRO 0.125mg/L) foi cultivado em placas de meio GC (R) e em placas com meio GC acrescido da concentração subinibitória de CRO (0.06mg/L) (RC) e um isolado com MIC CRO 0.0005mg/L foi cultivado em placas de meio GC (S). Foi realizado o sequenciamento de RNA Illumina (Novaseq 100bp paired-end) em triplicatas biológicas. A análise dos dados do RNA- Seq foi realizada no sistema Rockhopper. A análise das mutações nos genes sequenciados foi feita na plataforma NGSTAR. Os padrões encontrados para os isolados com MIC CRO (0,03 ? 0,125mg/L) foram os seguintes: mtrR: -35A del, ponA: L421P, penA: mosaico, porB: G120K / A121D. Os isolados com MIC < 0,004mg/L não apresentaram mutações em sua maioria. Os padrões de mutação encontrados nos isolados com redução de sensibilidade são idênticos ao de isolados que possuem resistência à CRO (MIC = 0,250mg/L), demonstrando a falta de diferenciação genotípica em cepas com sensibilidade distinta à CRO. Ao analisar os dados de RNA-Seq, foi possível identificar 244 genes diferencialmente expressos entre o isolado S e o isolado R. Entre os 20 genes com maior diferença na expressão, 7 estão relacionados a proteínas associadas ao fago, 5 são RNAs antissenso e 4 estão relacionados ao sistema de modificação- restrição do tipo III. Na comparação entre o isolado RC e o isolado R, foi possível observar 116 genes diferencialmente expressos, e entre os 20 genes com maior diferença na expressão encontramos 10 RNAs antissenso e 3 genes de proteínas hipotéticas. Foi possível observar que o sistema de restrição-modificação do tipo III pode ter relevância no fenótipo de resistência à CRO, bem como a transcrição de genes associados ao fago, presentes no transcriptoma dos 3 experimentos, o que carece de validação experimental. Além disso, a presença de CRO parece induzir uma resposta ao dano do DNA em NG, mediada por DinB e RecA. Ainda, verificamos que os componentes genômicos de resistência não são exclusivamente responsáveis por determinar a resistência à CRO.Observamos numerosas proteínas hipotéticas e a presença de RNAs antissenso nos experimentos sugerindo regulações transcricionais. Devido à ausência de informação revisada do genoma de NG, não foi possível realizar o enriquecimento de dados do conjunto de genes diferencialmente expressos, destacando um ponto nevrálgico das análises in silico.Abstract: Neisseria gonorrhoeae (NG) is the etiological agent of gonorrhea, a sexually transmitted infection that affects about 78 million people per year. Since the implementation of the treatment, gonococcus rapidly developed resistance mechanisms to the multiple classes of antimicrobials used to treat the infection. Nowadays, ceftriaxone (CRO) is the drug used as a first-line treatment recommended by the World Health Organization (WHO), although resistance to this drug was already described. Owing to the possibility of the gonococcal infection becoming untreatable, there is a need to understand the molecular and phenotypic mechanisms related to antimicrobial resistance mainly to ceftriaxone. In this study, we sequenced some genes (mtrR, penA, ponA and porB) and performed RNA sequencing to evaluate resistance mechanisms. To perform the transcriptome analysis, the NG isolate (MIC CRO 0.125mg/L) (R) was cultured in both GC medium plates and GC medium plates with CRO subinhibitory concentration (0.06mg/L) (RC) and a isolate with MIC CRO 0.0005mg/L was culture in GC medium plates (S). Illumina RNA sequencing was performed (Novaseq 100bp paired-end) in biological triplicates. RNA-Seq data analysis was performed in Rockhopper system. The SNP patterns found for MIC CRO isolates (0.03 - 0.125mg / L) were as follows: mtrR: -35A del, ponA: L421P, penA: mosaic, porB: G120K / A121D. The isolates with MIC <0.004mg /L did not present mutations mostly. The mutation patterns found in isolates with reduced sensitivity are identical to those of isolates that have resistance to CRO (MIC = 0.250mg/L), showing the lack of genotypic differentiation in strains with unequal susceptibility to CRO. By analyzing RNA-Seq data, it was possible to identify 244 genes differentially expressed between isolate S and isolate R. Among the 20 genes with major difference in expression, 7 are related to phage-associated proteins, 5 are antisense RNAs and 4 are related to the type III modification-restriction system. In the comparison between the RC isolate and the R isolate, it was possible to observe 116 differentially expressed genes, and among the 20 genes with the greatest difference in expression, we found 10 antisense RNAs and 3 hypothetical protein genes. It was possible to observe that the type III restriction-modification system may have relevance in the CRO resistance phenotype, as well as the transcription of genes associated with the phage, present in the transcriptome of the 3 experiments, which lacks experimental validation. In addition, the presence of CRO appears to induce a response to DNA damage in NG, mediated by DinB and RecA. Furthermore, we found that genomic resistance components are not exclusively responsible for determining resistance to CRO. We observed numerous hypothetical proteins and the presence of antisense RNAs in the experiments suggesting transcriptional regulations. Due to the lack of revised information on the NG genome, it was not possible to enrich data on the set of differentially expressed genes, highlighting fragile point of in silico analysis.Mazzon, Ricardo RuizBazzo, Maria LuizaUniversidade Federal de Santa CatarinaMachado, Hanalydia de Melo2020-10-21T21:31:26Z2020-10-21T21:31:26Z2020info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis125 p.| il., gráfs.application/pdf370075https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/216567porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2020-10-21T21:31:26Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/216567Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732020-10-21T21:31:26Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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