Engenharia genômica de linhagens de Saccharomyces cerevisiae visando prevenir a endocitose de transportadores de açúcares e aumentar a produção de etanol

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Santos, Angela Alves dos
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/231046
Resumo: Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2021.
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spelling Engenharia genômica de linhagens de Saccharomyces cerevisiae visando prevenir a endocitose de transportadores de açúcares e aumentar a produção de etanolBioquímicaSaccharomyces cerevisiaeEndocitoseXiloseGlicoseEndocitoseEtanolTese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2021.Modificar geneticamente a levedura Saccharomyces cerevisiae para permitir a utilização eficiente de xilose é crucial para o sucesso das biorrefinarias baseadas em biomassa de cana-de-açúcar, sobretudo para a produção do etanol de segunda geração, uma vez que a xilose é o segundo açúcar mais abundante nos hidrolisados lignocelulósicos. Entre as modificações genéticas necessárias, o transporte da pentose para o interior das células é um alvo interessante uma vez que é um dos passos limitantes para a eficiente fermentação deste açúcar. As estratégias para aumentar o transporte de xilose em S. cerevisiae incluem a modificação das permeases endógenas, e a expressão heteróloga de transportadores isolados de leveduras naturalmente fermentadoras de xilose. Contudo, S. cerevisiae possui um sistema de regulação pós-traducional que leva à endocitose e degradação de transportadores de membrana, mecanismo que depende da ubiquitinação dos transportadores pelo complexo arrestina-Rsp5. Além disso, os domínios citosólicos amino e/ou carboxi-terminal dos transportadores contendo lisinas também fazem parte do processo endocítico. Neste trabalho, em uma primeira abordagem, construímos linhagens de S. cerevisiae recombinantes, a partir de uma cepa hxt-null, com os genes ROD1 e/ou ROG3 deletados (que codificam as arrestinas Art4 e Art7, respectivamente), e avaliamos a capacidade de crescimento e fermentação dessas cepas expressando heterologamente os transportadores de xilose SpXUT1 e SaXUT1, provenientes das leveduras naturalmente fermentadoras de xilose Spathaspora passalidarum e Spathaspora arborariae, respectivamente. Nossos resultados revelaram que a deleção do gene ROG3 (Art7), mas não do gene ROD1 (Art4), permitiu melhor crescimento das células em meios contendo glicose e melhor consumo desta fonte de carbono, indicando que, nessa condição, a ausência da Art7 pode ter ocasionado a permanência dos dois transportadores nas membranas celulares, aumentando o consumo da hexose. No entanto, as deleções gênicas não melhoraram o perfil de crescimento ou fermentação de xilose pelas linhagens expressando os transportadores, o que indica que outras arrestinas podem fazer parte desse processo em meios contendo apenas xilose. Em outra abordagem, utilizamos uma cepa industrial de S. cerevisiae derivada da CAT-1 capaz de utilizar xilose (linhagem MP-C5), onde sobre-expressamos o transportador endógeno de baixa afinidade e alta capacidade Hxt1 e truncamos sua porção amino-terminal, originando a cepa MP-C5H1 (PADH1::[4-59?]HXT1). A estratégia desenvolvida manteve o transportador nas membranas celulares, tanto em meios contendo glicose como em xilose como única fonte de carbono, e permitiu o consumo total da xilose presente no meio (?40 g L-1) em 48 horas de fermentação, com produção de ?15 g L-1 de etanol, enquanto a cepa parental MP-C5 deixou ?18% da pentose sem ser consumida. Portanto, estes resultados destacam a importância da estabilização do transportador Hxt1 na membrana plasmática de S. cerevisiae para a fermentação eficiente de xilose. Assim sendo, as informações obtidas neste trabalho contribuem tanto para aumentar o conhecimento acerca da relação de arrestinas e transportadores de xilose heterólogos, quanto na aplicação de estratégias genômicas em cepas industriais. A linhagem industrial recombinante desenvolvida (MP-C5H1) constitui uma importante cepa para ser testada futuramente em fermentações industriais de hidrolisados lignocelulósicos.Abstract: Genetically modifying the yeast Saccharomyces cerevisiae to allow the efficient use of xylose is crucial for the success of sugarcane biomass-based biorefineries, especially for the production of second-generation ethanol, since xylose is the second most abundant sugar in lignocellulosic hydrolysates. Among the necessary genetic modifications, the transport of the pentose into the cells is an interesting target since it is one of the limiting steps for the efficient fermentation of this sugar. Strategies to increase xylose transport in S. cerevisiae include the modification of endogenous permeases and the heterologous expression of transporters isolated from naturally xylose-fermenting yeasts. However, S. cerevisiae has a post-translational regulatory system that leads to endocytosis and degradation of membrane transporters, a mechanism that depends on the ubiquitination of transporters by the arrestin-Rsp5 complex. Furthermore, the amino and/or carboxy-terminal cytosolic domains of lysine-containing transporters are also part of the endocytic process. In this work, in a first approach, we constructed recombinant S. cerevisiae strains, from an hxt-null strain, with the ROD1 and/or ROG3 genes deleted (which encode the arrestins Art4 and Art7, respectively), and evaluated the growth and fermentation capacity of these strains expressing the heterologous xylose transporters SpXUT1 and SaXUT1 from the naturally xylose-fermenting yeasts Spathaspora passalidarum and Spathaspora arborariae, respectively. Our results revealed that the deletion of the ROG3 (Art7) gene, but not the ROD1 (Art4) gene, allowed better cell growth in glucose-containing media and better consumption of this carbon source, indicating that, in this condition, the absence of Art7 may have caused the permanence of the two transporters in the cell membranes, increasing the consumption of the hexose. However, these genetic deletions did not improve the growth or fermentation profile with xylose by strains expressing the transporters, which indicates that other arrestins may be part of this process in media containing only xylose. In another approach, we used an industrial S. cerevisiae strain derived from CAT-1 capable of using xylose (strain MP-C5), where we overexpressed the high-capacity, low-affinity endogenous transporter Hxt1 and truncated its amino-terminal portion, originating strain MP-C5H1 (PADH1::[4-59?]HXT1). The developed strategy maintained the transporter in the cell membranes, both in media containing glucose as well as xylose as the only carbon source, and allowed the total consumption of the xylose present in the medium (?40 g L-1) within 48 hours of fermentation, with production of ?15 g L-1 of ethanol, while the parental MP-C5 strain left ?18% of the pentose unconsumed. Therefore, these results highlight the importance of stabilizing the Hxt1 transporter in the plasma membrane of S. cerevisiae for the efficient fermentation of xylose. Therefore, this work contributes both to increase the knowledge about the relationship of arrestins and heterologous xylose transporters, as well as to the application of genomic strategies in industrial strains. The developed recombinant industrial strain (MP-C5H1) is an important strain to be tested in the future in industrial fermentations of lignocellulosic hydrolysates.Stambuk, Boris Juan Carlos UgarteUniversidade Federal de Santa CatarinaSantos, Angela Alves dos2022-02-14T13:32:04Z2022-02-14T13:32:04Z2021info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis110 p.| il., gráfs.application/pdf373770https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/231046porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2022-02-14T13:32:04Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/231046Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732022-02-14T13:32:04Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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