Validação de métodos cromatográficos para avaliação de estreptoquinase e correlação com o bioensaio
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2016 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Manancial - Repositório Digital da UFSM |
Texto Completo: | http://repositorio.ufsm.br/handle/1/17602 |
Resumo: | The streptokinase (STK) is a secreted and isolated molecule of β-hemolytic streptococci, consists of 414 amino acids and clinically indicated as a thrombolytic agent for myocardial infarction, deep vein thrombosis, pulmonary embolism, acute or subacute peripheral arterial thrombosis. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid chromatography (SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of STK in biopharmaceutical formulations. A RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), Phenomenex, maintained at 25°C. The mobile phase consisted of 50 mM sodium sulphate buffer pH 7.0 and methanol (90:10, v/v), run isocratically at a flow rate of 0.8 mL/min. The SE-LC method was carried out on a Protein KW-802.5 column (300 mm x 8.0 mm i.d.), Shodex, maintained at 25°C. The mobile phase consisted of 40 mM sodium acetate buffer pH 7.0, run isocratically at a flow rate of 1.0 mL/min. Chromatographic separation was obtained with retention times of 19.3 min, and 14.1 min, and was linear over the concentration range of 85 - 25 000 IU/mL (R2 = 0.9999) and 600 – 8 000 IU/mL (R2 = 0.9991), respectively, for RP-LC and SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 220 nm and 204 nm. The limits of detection and quantification were 26 and 85 IU/mL, respectively, for the RP-LC and 190 and 600 IU/mL, for the SE-LC. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.24% and 99.88%, with bias lower than 0.99% and 0.62%. The validated methods were applied to the determination of STK, and related and higher molecular weight proteins in biopharmaceutical formulations, giving higher mean differences of the estimated content/potencies of 0.46% and 0.53% for the RP-LC and SE-LC related to the chromogenic bioassay, respectively. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biological medicine. |
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Validação de métodos cromatográficos para avaliação de estreptoquinase e correlação com o bioensaioValidation of chromatography methods for the evaluation of streptokinase and correlation with the bioassayEstreptoquinaseCromatografia líquidaValidaçãoBioensaioCorrelaçãoStreptokinaseLiquid chromatographyValidationBioassayCorrelationCNPQ::CIENCIAS DA SAUDE::FARMACIAThe streptokinase (STK) is a secreted and isolated molecule of β-hemolytic streptococci, consists of 414 amino acids and clinically indicated as a thrombolytic agent for myocardial infarction, deep vein thrombosis, pulmonary embolism, acute or subacute peripheral arterial thrombosis. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid chromatography (SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of STK in biopharmaceutical formulations. A RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), Phenomenex, maintained at 25°C. The mobile phase consisted of 50 mM sodium sulphate buffer pH 7.0 and methanol (90:10, v/v), run isocratically at a flow rate of 0.8 mL/min. The SE-LC method was carried out on a Protein KW-802.5 column (300 mm x 8.0 mm i.d.), Shodex, maintained at 25°C. The mobile phase consisted of 40 mM sodium acetate buffer pH 7.0, run isocratically at a flow rate of 1.0 mL/min. Chromatographic separation was obtained with retention times of 19.3 min, and 14.1 min, and was linear over the concentration range of 85 - 25 000 IU/mL (R2 = 0.9999) and 600 – 8 000 IU/mL (R2 = 0.9991), respectively, for RP-LC and SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 220 nm and 204 nm. The limits of detection and quantification were 26 and 85 IU/mL, respectively, for the RP-LC and 190 and 600 IU/mL, for the SE-LC. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.24% and 99.88%, with bias lower than 0.99% and 0.62%. The validated methods were applied to the determination of STK, and related and higher molecular weight proteins in biopharmaceutical formulations, giving higher mean differences of the estimated content/potencies of 0.46% and 0.53% for the RP-LC and SE-LC related to the chromogenic bioassay, respectively. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biological medicine.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESA estreptoquinase (STK) é uma molécula secretada e isolada de estreptococos β-hemolíticos, constituída de 414 aminoácidos e clinicamente indicada como agente trombolítico para o infarto agudo do miocárdio, trombose venosa profunda, embolia pulmonar, trombose arterial periférica aguda ou subaguda. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de STK em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método por CL-FR foi utilizada coluna Jupiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), Phenomenex, mantida a 25ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 50 mM, pH 7,0, e a fase móvel B por metanol (90:10, v/v), eluída sob fluxo isocrático de 0,8 mL/min. No método por CL-EM foi utilizada coluna Protein KW-802.5 (300 mm x 8,0 mm d.i.), Shodex, mantida a 25ºC. A fase móvel foi constituída de tampão acetato de sódio 40 mM, pH 7,0, eluída em vazão isocrática de 1,0 mL/min. Utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) a 220 nm e 204 nm, para CL-FR e CL-EM, respectivamente. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 19,3 min e 14,1 min, sendo linear na faixa de concentração de 85 - 25 000 UI/mL (R2 = 0,9999) e 600 – 8 000 UI/mL (R2 = 0,9991), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e quantificação foram 26 e 85 UI/mL, respectivamente, para o método por CL-FR e 190 e 600 UI/mL por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, e demonstrou-se também que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,24% e 99,88%, com bias inferior a 0,99% e 0,62%, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os métodos propostos foram aplicados para a avaliação da potência de STK, de formas degradadas ou alteradas, de proteínas relacionadas e de alta massa molecular em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio cromogênico, observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,46% e 0,53% superiores para os métodos por CL-FR e CL-EM, respectivamente. Concluiu-se que o trabalho representa contrbuição para estabelecer novas alternativas para monitorar a estabilidade e o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico. Do mesmo modo, também estabelecem bases para estudos de comparabilidade de biomoléculas, garantindo a segurança e eficácia.Universidade Federal de Santa MariaBrasilAnálises Clínicas e ToxicológicasUFSMPrograma de Pós-Graduação em Ciências FarmacêuticasCentro de Ciências da SaúdeDalmora, Sergio Luizhttp://lattes.cnpq.br/4505166045049607Vaucher, Lauren Rosa Crossettihttp://lattes.cnpq.br/7468913314581754Rocha, Andréa da Silva Ramoshttp://lattes.cnpq.br/1207655504558175Cardoso Júnior, Clóvis Dervil Appratto2019-07-29T21:59:06Z2019-07-29T21:59:06Z2016-03-30info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://repositorio.ufsm.br/handle/1/17602porAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internationalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Manancial - Repositório Digital da UFSMinstname:Universidade Federal de Santa Maria (UFSM)instacron:UFSM2022-05-06T18:01:36Zoai:repositorio.ufsm.br:1/17602Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttps://repositorio.ufsm.br/ONGhttps://repositorio.ufsm.br/oai/requestatendimento.sib@ufsm.br||tedebc@gmail.comopendoar:2022-05-06T18:01:36Manancial - Repositório Digital da UFSM - Universidade Federal de Santa Maria (UFSM)false |
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The streptokinase (STK) is a secreted and isolated molecule of β-hemolytic streptococci, consists of 414 amino acids and clinically indicated as a thrombolytic agent for myocardial infarction, deep vein thrombosis, pulmonary embolism, acute or subacute peripheral arterial thrombosis. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid chromatography (SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of STK in biopharmaceutical formulations. A RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), Phenomenex, maintained at 25°C. The mobile phase consisted of 50 mM sodium sulphate buffer pH 7.0 and methanol (90:10, v/v), run isocratically at a flow rate of 0.8 mL/min. The SE-LC method was carried out on a Protein KW-802.5 column (300 mm x 8.0 mm i.d.), Shodex, maintained at 25°C. The mobile phase consisted of 40 mM sodium acetate buffer pH 7.0, run isocratically at a flow rate of 1.0 mL/min. Chromatographic separation was obtained with retention times of 19.3 min, and 14.1 min, and was linear over the concentration range of 85 - 25 000 IU/mL (R2 = 0.9999) and 600 – 8 000 IU/mL (R2 = 0.9991), respectively, for RP-LC and SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 220 nm and 204 nm. The limits of detection and quantification were 26 and 85 IU/mL, respectively, for the RP-LC and 190 and 600 IU/mL, for the SE-LC. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.24% and 99.88%, with bias lower than 0.99% and 0.62%. The validated methods were applied to the determination of STK, and related and higher molecular weight proteins in biopharmaceutical formulations, giving higher mean differences of the estimated content/potencies of 0.46% and 0.53% for the RP-LC and SE-LC related to the chromogenic bioassay, respectively. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biological medicine. |
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