Efeito modulatório de proteoglicanos sobre a atividade da enzima óxido nítrico sintase endotelial em células CHO

• Autor(a) principal: Lucena, Sheyla Varela [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=2359173; https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/48777
• topic: Óxido nítrico; Enos; Glicosaminoglicanos; Proteoglicanos; Sinalização celular; Células cho

Introdução. A interação das células com a matriz extracelular (MEC) e com as células vizinhas são essenciais para o desempenho das funções celulares. A maneira pela qual as células adquirem informações sobre o meio extracelular se dá por meio de interações mediadas por receptores específicos entre a MEC e os constituintes de superfície celular, tais como, integrinas, proteoglicanos entre outros. Dados da literatura mostram que os proteoglicanos, via suas cadeias de glicosaminoglicanos (GAGs), são capazes de interagir com várias proteínas da MEC e com integrinas da superfície celular que por sua vez, interagem com moléculas da MEC. Essas interações GAGs/integrina modulam a formação do complexo ternário integrina/GAGs/proteínas da MEC controlando dessa forma o papel biológico das integrinas. Estímulos mecânicos derivados da MEC podem ser transmitidos para o meio intracelular pela interação direta ou indireta das integrinas que se associam com proteoglicanos em regiões de "lipíd rafts" e no complexo focal de adesão controlando a produção intracelular de NO. [Objetivos] Considerando que os proteoglicanos controlam a atividade de integrinas na superfície celular, decidimos investigar a influência dos GAGs nos mecanismos responsáveis pela produção de óxido nítrico em células selvagem CHO-K1, bem como, em células mutante CHO-745, defectiva da enzima xilosiltransferase, enzima fundamental para a biossíntese de GAGs. [Métodos] Analisamos o balanço redox nas células CHO-K1 e CHO-745 pela quantificação de GSH/GSSG, de grupos tióis, da razão NADP/NADPH, bem como, pela análise da expressão gênica das enzimas GPx, TRX e catalasepor RTPCR. Analisamos a susceptibilidade das células CHO para a morte celular frente a sobrecarga do agente pró-oxidante. Os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROS), de superóxido e de óxido nítrico foram analisados em ambas as linhagens celulares CHO por sondas fluorescentes em microscopia TIRF e confocal. Também foi analisada a expressão gênica das isoformas de NADPH oxidase e NO sintase envolvidas na produção de superóxido e NO nas células CHO por westem blottíng e citometria de fluxo. A localização celular da enzima eNOS nas células CHO foi analisada por microscopia confocal. Verificamos a via de sinalização celular envolvida no controle da atividade da enzima eNOS nas células CHO por western blotting, microscopia TIRF e confocal. [Resultados]. Nossos resultados mostram que as células mutantes CHO-745 são mais susceptíveis a morte celular induzida por agente pró-oxidante que as células selvagem CHO-K1. Verificamos que as células mutantes CHO-745 produzem espontaneamente cerca de 12 vezes mais EROS do que as células selvagens CHO-K1. A principal fonte de EROS produzidos espontaneamente pelas células CHO-745 está associada a sua elevada produção de NO, o qual também cerca de 12 vezes maior nas células mutantes CHO-745 em relação às células selvagem CHO-K1. Os resultados mostram que a isoforma eNOS é a principal responsável pela produção de NO nas células CHO. Os resultados mostram que a presença de GAGs, verificada nas células CHO-K1 inibe a via de sinalização Integrina/FAKlPI3K/Akt,. a qual leva a ativação da eNOS por fosforilação de Ser1177. Além disso, as células CHO-K1 apresentam maior ativação constitutiva da enzima PKC, cerca de duas vezes mais, do que as células CHO-745. Essa ativação da PKCa resulta na fosforilação no resíduo inibitório Thr495 da eNOS. A elevada produção de NO nas células CHO-745 promoveu também uma elevada taxa de S-nitrosilação de resíduos de cisteína em suas proteínas, bem como, elevada taxa de nitração de grupos fenólicos de tirosina. Ainda foi observado que as células CHO-745 possuem uma concentração basal de superóxido menor em comparação com as células CHO-K1. Nossos resultados mostram que as células CHO-745 apresentam níveis elevados de expressão gênica das enzimas GPx, TRX e catalase em resposta a sua maior produção de EROs. [Conclusão] Esses resultados mostram que a enzima eNOS está muito mais ativada nas células mutante CHO-745 do que as células CHO-K1 devido a sua maior fosforilação do resíduo excitatório Ser1177 e menor fosforilação em seu resíduo inibitório Thr495, a fosforilização desses resíduos é modulada por GAGs/PG da superfície celular. Esses resultados mostram que os GAGs estão envolvidos no controle do balanço oxidativo/nitrosativo celular.