Estudos genéticos sobre a virulência de Escherichia coli enteroagregativa atípica

• Autor(a) principal: Zamboni, Andresa [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2006
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9598
• topic: Escherichia coli enteroagregativa; Fatores de virulência; Diarréia; Escherichia coli; Virulence factors; Diarrhea

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente, associado à doença diarréica, que apresenta como característica o padrão de adesão agregativo (AA) a superfície de células HEp-2. O fenótipo AA está associado à presença de um plasmídeo de 65 MDa, conhecido como plasmídeo pAA, detectado através de uma sonda genética denominada de CVD432 ou simplesmente AA. Algumas amostras de EAEC, entretanto, apresentam o padrão AA, mas não são portadoras do plasmídeo. No plasmídeo pAA estão presentes vários genes relacionados com as propriedades de virulência, dentre os quais aqueles que codificam as adesinas fimbrias AAF (“Aggregative Adherence Factor” - AAF/I, AAF/II e AAF/III), o regulador de transcrição AggR, a proteína antiagregação (Aap) e as toxinas Pet e EAST1. Outros fatores de virulência de EAEC são codificados por genes cromossômicos, entre eles, a enterotoxina ShET1, o sideróforo Yersiniabactin (irp2), uma ORF críptica (Shf), e uma a-hemolisina. A maioria dos estudos sobre mecanismos de virulência de EAEC compreende amostras que apresentam o padrão AA e que reagem com a sonda AA, ou seja, as amostras de EAEC típicas. Pouco se conhece sobre a presença de potenciais fatores de virulência em amostras de EAEC sonda-negativas, descritas por nós como EAEC atípicas. Neste estudo analisamos 28 amostras de EAEC atípicas isoladas de crianças com diarréia (N = 18) e sem diarréia (N = 10) provenientes de várias cidades brasileiras quanto à presença de seqüências genéticas associadas aos fatores de virulência codificados no plasmídeo pAA e no cromossomo. A maioria das amostras era portadora de dois ou mais genes de virulência, sendo a média dois; porém, duas amostras controles foram negativas para todos os marcadores de virulência pesquisados. Os genes astA, pet, shf, shET/1/pic, irp2 e hly foram encontrados mais freqüentemente em amostras isoladas de casos do que de controles. Quatro amostras apresentaram o gene aggR e em uma delas foi encontrado também as seqüências genéticas aafA e aap. A combinação dos genes astA e shf, foi encontrada em 16 (57%) amostras e 7 (25%) amostras eram portadoras das sequências genéticas astA, shf e irp2.Entre as amostras estudadas, os marcadores genéticos codificados por genes plasmidiais, astA, relacionada a produção de EAST1, e shf associada a uma ORF críptica, foram os mais freqüentes (61%) e apresentaram uma freqüência significantemente maior nos casos do que nos controles estudados (P = 0,003 e P = 0,020, respectivamente). A maioria das amostras de EAEC atípicas estudadas reagiu com um dos 175 antissoros utilizados, sendo que alguns desses, como os sorogrupos O42, O126 e O162 foram os mais freqüentes e encontrados apenas nas amostras isoladas de casos. A análise do perfil plasmidial de 12 amostras isoladas de crianças com diarréia mostrou a presença de mais de um plasmídeo de alto peso molecular na maioria das amostras estudadas. Duas amostras, uma contendo apenas um plasmídeo e uma outra sem nenhum plasmídeo foram então selecionadas para caracterização dos genes envolvidos no padrão AA. A amostra RN691-2 portadora de um único plasmídeo e apresentando resistência antimicrobiana múltipla, foi submetida a experimentos de transformação, conjugação e cura, não sendo possível à obtenção de um transformante, transconjugante ou mesmo a amostra isogênica sem o plasmídeo. Com o objetivo de identificar o(s) gene(s) envolvidos no padrão AA da amostra RN153-1, sem nenhum plasmídeo, foi construída uma biblioteca genômica e identificado um clone-cosmídeo, designado pVIII-F-1, que apresentou o padrão AA em células HEp-2 de maneira semelhante à amostra selvagem. Para localizar o gene necessário para a adesão, o clone cosmídeo foi submetido a mutagênese com o transposon mini-Tn10 (CmR), sendo identificado o mutante pVIII-F-1