Estudo de propriedades biofísicas de vesículas unilamelares gigantes como modelo para entrega intracelular de materiais: eletroporação e fusão de membranas

• Autor(a) principal: Lira, Rafael Bezerra de [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4045018; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47260
• topic: Membranas; Eletroporação; Fusão; Tensão de linha; Fret; Guvs; Microscopia ótica; Membranes; Electroporation; Fusion; Line voltage; Fret; Guvs; Optical microscopy

As membranas são as estruturas que definem os limites das células, atuando como uma barreira seletiva e regulando o transporte intra e extracelular. Várias substâncias biológicas têm seu alvo no interior da célula, mas não conseguem atravessar as membranas e alcançá-los. Portanto, vários métodos de entrega intracelular de materiais vêm sendo desenvolvidos; entre eles a eletroporação e lipossomas fusogênicos. Na eletroporação, um ou mais pulsos elétricos intensos são aplicados e a membrana plasmática se torna transientemente permeável, permitindo a entrada de substâncias na célula. O método é eficiente mas apresenta elevada toxicidade. A fusão entre lipossomas e células resulta na entrega da substância encapsulada nos lipossomas, mas os mecanismos são pouco conhecidos e a eficiência é limitada. Modelos biomiméticos são geralmente empregados para simular sistemas reais de forma controlada. Um dos sistemas biomiméticos de membranas mais utilizados são as vesículas unilamelares gigantes (GUVs). Nesta tese, são usadas GUVs de lipídeos zwiteriônicos (PC) e misturas com lipídeos aniônicos (PG) para estudar processos de eletroporação e fusão com lipossomas fusogênicos, e ambos os processos são estudados por uma série de técnicas microscópicas. Poros eletroformados em GUVs eletricamente neutras são transientes, com tempo de vida de poucas centenas de milissegundos. Em contraste, poros formados em algumas GUVs negativas abrem indefinidamente, levando ao total colapso da vesícula, num processo batizado de bursting. Os resultados aqui mostram que a fração de bursting depende da fração de PG na membrana, do grau de insaturação nos lipídeos (lipídeos com insaturação em uma ou ambas as caudas hidrofóbicas) e de determinados aditivos do meio, especialmente o Ca2+. A propensão ao bursting está relacionada à redução da tensão de linha do poro (?), de 57,9±26,1 e 53,7±11,5 pN em membranas neutras de POPC e DOPC, respectivamente, para valores menores que 20 pN em membranas contendo frações de PG ? 20 mol%. Tal redução também depende da presença de determinados aditivos no meio, com valores de ? mais elevados na presença de Ca+2 relativo a Na+, mas apenas para PG ? 20 mol%. A propensão à desestabilização é, portanto, resultado da redução de ?. Poros formados membranas carregadas têm composição similar às regiões de membranas íntegra, independente da carga de membrana. Poros remanescentes após eletroporação de GUVs negativas apresentam permeabilidade a macromoléculas. Membranas negativas também apresentam diferenças em outras propriedades de membrana comparadas a membranas neutras, como redução na mobilidade de lipídeos, aumento da ordem e da curvatura espontânea. A fusão de GUVs com diferentes frações de PG em membranas de PC, com lipossomas catiônicos fusogênicos, foi estudada num novo sistema fusogênico LUV-GUV, em que a fusão foi observada em tempo real e seus efeitos diretamente observados e quantificados no microscópio. Nesse sistema, vários dos intermediários de fusão (adesão, hemifusão e fusão completa) podem ser 4 detectados e as transformações morfológicas de membrana são observadas diretamente. Ensaios de Transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) permitem medir a quantidade de lipídeos transferidos das LUVs para GUVs, e mostraram que a transição hemifusão-fusão completa ocorre para faixas de PG 10-20 mol%. A baixas frações molares de PG (? 10 mol%), a interação resulta primariamente em adesão e hemifusão, aumentando a tensão de membrana, enquanto a elevadas frações (? 20 mol%), a interação resulta em fusão completa, levando ao aumento de área das GUVs. A construção de uma curva de calibração FRET permite determinar a composição da membrana após fusão em cada GUV individualmente. Durante hemifusão, a quantidade de lipídeo catiônico transferido das LUVs é < 5 mol%, enquanto a fusão completa em composição final contendo até 20 mol% desse lipídeo. Em todos os casos, a fusão se dá por neutralização de cargas. Os resultados apresentados aqui (i) esclarecem os mecanismos responsáveis pelo processo de bursting de GUVs negativas, (ii) definem os determinantes de carga de membrana de GUVs num sistema de fusão de membranas de cargas opostas, e (iii) mostram que várias propriedades de membranas eletricamente carregadas são distintas daquelas em membranas neutras. Nós acreditamos que esses achados devem ajudar o desenvolvimento de sistemas de entrega intracelular de forma mais eficiente com o mínimo de efeitos adversos.