Papel do Sindecam-4 na sinalização de células endoteliais resistentes ao anoikis
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2023 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UNIFESP |
Texto Completo: | https://repositorio.unifesp.br/11600/68403 |
Resumo: | A morte celular programada por falta de adesão da célula à matriz extracelular é denominada anoikis. Muitas células tumorais são resistentes ao anoikis, o que facilita a invasão dessas células em outros tecidos, assim favorecendo a metástase tumoral. Dados anteriores do nosso laboratório demonstraram que células endoteliais resistentes ao anoikis apresentam alterações morfológicas, alta taxa de proliferação, baixa adesão à fibronectina, laminina e colágeno IV, desregulação do ciclo celular, além de elevado potencial invasivo, baixa taxa de apoptose, aumento na expressão de sindecam-4 e aumento na expressão de PI3K, ERK e H-Ras. Foi demonstrado que o silenciamento gênico do sindecam-4 reverteu o comportamento tumoral das células endoteliais resistentes ao anoikis, diminuindo a capacidade proliferativa, invasiva e angiogênica e aumentando a adesão celular. Esses processos celulares são mediados por vias de sinalização, onde as células estão constantemente enviando e recebendo sinais ao seu redor. Embora alguns estudos tenham demonstrado o papel do sindecam-4 na regulação desses processos biológicos, poucos definiram o papel específico dessa macromolécula na sinalização celular. O objetivo desse trabalho é estudar a expressão das proteínas envolvidas nas vias de sinalização PI3K/AKT e Ras/ERK em células endoteliais da aorta de coelho resistentes ao anoikis, buscando um melhor entendimento do papel do sindecam-4 na regulação da sinalização celular. Para isso, estudamos comparativamente células endoteliais de aorta de coelho (EC), EC transfectadas com oncogene EJ-ras (EJ-ras-EC), células endoteliais de aorta de coelho resistente ao anoikis (Adh-EC) e células endoteliais resistentes ao anoikis (Adh1-EC) que foram transfectadas com micro RNA de interferência para o sindecam-4 (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC). Para o estudo da expressão gênica foi realizada a técnica de qPCR em tempo real (RT-qPCR) e para a expressão proteica foi realizado o ensaio de Western Blotting. A determinação da localização dessas proteínas foi realizada utilizando a técnica de imunofluorescência. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando o programa GraphPad Prism 6, com valor de significância p<0,05. Os resultados demonstraram que as linhagens silenciadas miR-Syn-4-1-Adh-EC e mir-Syn-4-2-Adh-EC apresentaram diminuição na expressão gênica de PI3K, PTEN, AKT, mTOR, H-Ras e ERK em relação às células anoikis resistentes (Adh1-EC). O silenciamento do sindecam-4 levou a uma diminuição na expressão proteica de PI3K total, PI3K (p85), AKT total, mTOR total, H-Ras e p 44/42 MAPK (ERK1/2). E as proteínas PTEN e PI3K (p110α) tiveram aumento na sua expressão nas linhagens silenciadas do estudo. Nas imagens obtidas pela técnica de imunofluorescência foi possível observar uma diminuição da expressão proteica de PI3K, mTOR, H-Ras e ERK nas linhagens miR-Syn-4-1-Adh-EC e miR-Syn-4-2-Adh-EC em relação a Adh1-EC, corroborando com os dados obtidos nos ensaios de Western Blotting. Assim, este estudo revelou que regulação negativa da expressão de SDC4 induziu a modulação das vias PI3K/AKT e Ras/ERK, promovendo a reversão do fenótipo alterado das células resistentes ao anoikis, levando-as a características semelhantes as células EC selvagens. Este estudo identificou o sindecam-4 como um regulador importante da sinalização celular em células resistentes ao anoikis e sugere que sua regulação negativa pode ser uma estratégia promissora para o tratamento do câncer. |
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Machado, Ranyelison Silva [UNIFESP]http://lattes.cnpq.br/1207583472762150http://lattes.cnpq.br/6280504619546509Lopes, Carla Cristina [UNIFESP]São Paulo2023-06-29T15:07:05Z2023-06-29T15:07:05Z2023-04-19https://repositorio.unifesp.br/11600/68403A morte celular programada por falta de adesão da célula à matriz extracelular é denominada anoikis. Muitas células tumorais são resistentes ao anoikis, o que facilita a invasão dessas células em outros tecidos, assim favorecendo a metástase tumoral. Dados anteriores do nosso laboratório demonstraram que células endoteliais resistentes ao anoikis apresentam alterações morfológicas, alta taxa de proliferação, baixa adesão à fibronectina, laminina e colágeno IV, desregulação do ciclo celular, além de elevado potencial invasivo, baixa taxa de apoptose, aumento na expressão de sindecam-4 e aumento na expressão de PI3K, ERK e H-Ras. Foi demonstrado que o silenciamento gênico do sindecam-4 reverteu o comportamento tumoral das células endoteliais resistentes ao anoikis, diminuindo a capacidade proliferativa, invasiva e angiogênica e aumentando a adesão celular. Esses processos celulares são mediados por vias de sinalização, onde as células estão constantemente enviando e recebendo sinais ao seu redor. Embora alguns estudos tenham demonstrado o papel do sindecam-4 na regulação desses processos biológicos, poucos definiram o papel específico dessa macromolécula na sinalização celular. O objetivo desse trabalho é estudar a expressão das proteínas envolvidas nas vias de sinalização PI3K/AKT e Ras/ERK em células endoteliais da aorta de coelho resistentes ao anoikis, buscando um melhor entendimento do papel do sindecam-4 na regulação da sinalização celular. Para isso, estudamos comparativamente células endoteliais de aorta de coelho (EC), EC transfectadas com oncogene EJ-ras (EJ-ras-EC), células endoteliais de aorta de coelho resistente ao anoikis (Adh-EC) e células endoteliais resistentes ao anoikis (Adh1-EC) que foram transfectadas com micro RNA de interferência para o sindecam-4 (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC). Para o estudo da expressão gênica foi realizada a técnica de qPCR em tempo real (RT-qPCR) e para a expressão proteica foi realizado o ensaio de Western Blotting. A determinação da localização dessas proteínas foi realizada utilizando a técnica de imunofluorescência. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando o programa GraphPad Prism 6, com valor de significância p<0,05. Os resultados demonstraram que as linhagens silenciadas miR-Syn-4-1-Adh-EC e mir-Syn-4-2-Adh-EC apresentaram diminuição na expressão gênica de PI3K, PTEN, AKT, mTOR, H-Ras e ERK em relação às células anoikis resistentes (Adh1-EC). O silenciamento do sindecam-4 levou a uma diminuição na expressão proteica de PI3K total, PI3K (p85), AKT total, mTOR total, H-Ras e p 44/42 MAPK (ERK1/2). E as proteínas PTEN e PI3K (p110α) tiveram aumento na sua expressão nas linhagens silenciadas do estudo. Nas imagens obtidas pela técnica de imunofluorescência foi possível observar uma diminuição da expressão proteica de PI3K, mTOR, H-Ras e ERK nas linhagens miR-Syn-4-1-Adh-EC e miR-Syn-4-2-Adh-EC em relação a Adh1-EC, corroborando com os dados obtidos nos ensaios de Western Blotting. Assim, este estudo revelou que regulação negativa da expressão de SDC4 induziu a modulação das vias PI3K/AKT e Ras/ERK, promovendo a reversão do fenótipo alterado das células resistentes ao anoikis, levando-as a características semelhantes as células EC selvagens. Este estudo identificou o sindecam-4 como um regulador importante da sinalização celular em células resistentes ao anoikis e sugere que sua regulação negativa pode ser uma estratégia promissora para o tratamento do câncer.Programmed cell death due to lack of adhesion of the cell to the extracellular matrix is called anoikis. Many tumor cells are resistant to anoikis, which facilitates the invasion of them into other tissues, thus favoring tumor metastasis. Previous data from our laboratory demonstrated that anoikis resistant endothelial cells show morphological alterations, high proliferation rate, low adhesion to fibronectin, laminin, and collagen IV, cell cycle dysregulation, as well as high invasive potential, low apoptosis rate, increased expression of syndecan-4, and increased expression of PI3K, ERK and H-Ras. Recently, we demonstrated that gene silencing of syndecan-4 reversed the tumor behavior of anoikis resistant endothelial cells, decreasing proliferative, invasive, and angiogenic capacity and increasing cell adhesion. These cellular processes are mediated by signaling pathways, where cells are constantly sending and receiving signals to their surroundings. Although some studies have demonstrated the role of syndecan-4 in regulating these biological processes, few have defined the specific role of this macromolecule in cell signaling. This work aims to study the expression of proteins involved in the PI3K/AKT and Ras/ERK signaling pathways in anoikis resistant rabbit aortic endothelial cells, seeking a better understanding of the role of syndecan-4 in the regulation of cell signaling. For this, we studied comparatively rabbit aortic endothelial cells (EC), EC transfected with EJ-ras oncogene (EJ-ras-EC), anoikis resistant rabbit aortic endothelial cells (Adh-EC), and anoikis resistant endothelial cells (Adh1-EC) that were transfected with micro interference RNA for syndecan-4 (miR-Syn-4-1-Adh1EC and miR-Syn-4-2-Adh1-EC). For the study of gene expression, the real-time qPCR technique (RT-qPCR) was performed and for protein expression, the Western Blotting assay was performed. The determination of the localization of these proteins was done using the immunofluorescence technique. The data obtained were statistically analyzed using the GraphPad Prism 6 program, with a significance value of p<0.05. With this, we observed that miR-Syn-4-1-Adh-EC and miR-Syn-4-2-Adh-EC silenced strains showed decreased gene expression of PI3K, PTEN, AKT, mTOR, H-Ras, and ERK compared to resistant anoikis (Adh1-EC). Silencing of syndecan-4 led to decreased protein expression of total PI3K, PI3K (p85), total AKT, total mTOR, H-Ras, and p44/42 MAPK (ERK1/2). PTEN and PI3K (p110α) proteins had increased expression in the silenced strains of the study. In the images obtained by the immunofluorescence technique, a decrease in the protein expression of PI3K, mTOR, H-Ras and ERK could be observed in the miR-Syn-4-1-Adh-EC and miR-Syn-4-2-Adh-EC strains relative to Adh1-EC, corroborating the data obtained in the Western Blotting assays. Thus, this study revealed that negative regulation of SDC4 expression induced modulation of PI3K/AKT and Ras/ERK pathways, promoting reversal of the altered phenotype of anoikis resistant cells, leading them to wild-type EC-like characteristics. This study identified syndecam-4 as an important regulator of cell signaling in anoikis resistant cells and suggests that its downregulation may be a promising strategy for cancer treatment.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)103 f.porUniversidade Federal de São PauloAnoikisResistência ao anoikisSindecam-4Vias de sinalizaçãoPI3K/AKTRas/ERKPapel do Sindecam-4 na sinalização de células endoteliais resistentes ao anoikisRole of syndecan-4 in signaling of endothelial cellsresistant to anoikis.info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UNIFESPinstname:Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)instacron:UNIFESPEscola Paulista de Medicina (EPM)Ciências Biológicas (Biologia Molecular)ORIGINALTese mestrado - Ranyelison Machado (1).pdfTese mestrado - Ranyelison Machado (1).pdfDissertação de Mestrado 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A morte celular programada por falta de adesão da célula à matriz extracelular é denominada anoikis. Muitas células tumorais são resistentes ao anoikis, o que facilita a invasão dessas células em outros tecidos, assim favorecendo a metástase tumoral. Dados anteriores do nosso laboratório demonstraram que células endoteliais resistentes ao anoikis apresentam alterações morfológicas, alta taxa de proliferação, baixa adesão à fibronectina, laminina e colágeno IV, desregulação do ciclo celular, além de elevado potencial invasivo, baixa taxa de apoptose, aumento na expressão de sindecam-4 e aumento na expressão de PI3K, ERK e H-Ras. Foi demonstrado que o silenciamento gênico do sindecam-4 reverteu o comportamento tumoral das células endoteliais resistentes ao anoikis, diminuindo a capacidade proliferativa, invasiva e angiogênica e aumentando a adesão celular. Esses processos celulares são mediados por vias de sinalização, onde as células estão constantemente enviando e recebendo sinais ao seu redor. Embora alguns estudos tenham demonstrado o papel do sindecam-4 na regulação desses processos biológicos, poucos definiram o papel específico dessa macromolécula na sinalização celular. O objetivo desse trabalho é estudar a expressão das proteínas envolvidas nas vias de sinalização PI3K/AKT e Ras/ERK em células endoteliais da aorta de coelho resistentes ao anoikis, buscando um melhor entendimento do papel do sindecam-4 na regulação da sinalização celular. Para isso, estudamos comparativamente células endoteliais de aorta de coelho (EC), EC transfectadas com oncogene EJ-ras (EJ-ras-EC), células endoteliais de aorta de coelho resistente ao anoikis (Adh-EC) e células endoteliais resistentes ao anoikis (Adh1-EC) que foram transfectadas com micro RNA de interferência para o sindecam-4 (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC). Para o estudo da expressão gênica foi realizada a técnica de qPCR em tempo real (RT-qPCR) e para a expressão proteica foi realizado o ensaio de Western Blotting. A determinação da localização dessas proteínas foi realizada utilizando a técnica de imunofluorescência. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando o programa GraphPad Prism 6, com valor de significância p<0,05. Os resultados demonstraram que as linhagens silenciadas miR-Syn-4-1-Adh-EC e mir-Syn-4-2-Adh-EC apresentaram diminuição na expressão gênica de PI3K, PTEN, AKT, mTOR, H-Ras e ERK em relação às células anoikis resistentes (Adh1-EC). O silenciamento do sindecam-4 levou a uma diminuição na expressão proteica de PI3K total, PI3K (p85), AKT total, mTOR total, H-Ras e p 44/42 MAPK (ERK1/2). E as proteínas PTEN e PI3K (p110α) tiveram aumento na sua expressão nas linhagens silenciadas do estudo. Nas imagens obtidas pela técnica de imunofluorescência foi possível observar uma diminuição da expressão proteica de PI3K, mTOR, H-Ras e ERK nas linhagens miR-Syn-4-1-Adh-EC e miR-Syn-4-2-Adh-EC em relação a Adh1-EC, corroborando com os dados obtidos nos ensaios de Western Blotting. Assim, este estudo revelou que regulação negativa da expressão de SDC4 induziu a modulação das vias PI3K/AKT e Ras/ERK, promovendo a reversão do fenótipo alterado das células resistentes ao anoikis, levando-as a características semelhantes as células EC selvagens. Este estudo identificou o sindecam-4 como um regulador importante da sinalização celular em células resistentes ao anoikis e sugere que sua regulação negativa pode ser uma estratégia promissora para o tratamento do câncer. |
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