Aspectos genéticos e da dinâmica da interação de Escherichia coli enteropatogênica atípica e E. albertti com células epiteliais

• Autor(a) principal: Romão, Fabiano Teodoro [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5554474; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50703
• topic: Escherichia Spp; Diarreia; Patógenos; Sistema de secreção tipo 3; Interação bactéria-célula; Attaching and effacing

Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) e Escherichia albertii, reconhecidos enteropatógenos em diversas regiões geográficas, produzem lesão attaching-effacing (AE) em enterócitos. A formação da lesão depende da interação da adesina intimina e do seu receptor, Tir, que é translocado pelo Sistema de Secreção do Tipo 3. Os genes envolvidos na formação da lesão AE estão localizados na região LEE (locus of enterocyte effacement), mas existem algumas lacunas no conhecimento sobre como são expressos durante a interação com as células do hospedeiro. Objetivos: Estudar dois patógenos produtores de lesão AE, aEPEC 1711-4 e E. albertii 1551-2, com relação à expressão dos cinco operons da região LEE, nas diversas fases da interação com enterócitos (adesão, invasão e persistência intracelular), bem como a ocorrência de alterações (quantitativas e qualitativas) na interação bacteriana nessas diferentes fases. Além disso, pretendeuse analisar o genoma dessas cepas para se verificar o eventual envolvimento de proteínas efetoras e de outros potenciais fatores de virulência que poderiam estar associados ao processo de invasão e persistência intracelular. Métodos: Foram avaliadas as alterações qualitativas e quantitativas de adesão, produção de lesão AE, invasão e persistência intracelular em células intestinais Caco-2 polarizadas e diferenciadas, empregando-se um estudo cinético (1,5 h; 3 h; 6 h e 24 h de interação). RT-PCR foi empregado para analisar e comparar a expressão de genes representativos dos cinco operons da região LEE (ler, escC, escV, eae e espA), nesses diferentes períodos de interação. Para a aEPEC 1711-4, foi também analisada a expressão do gene fliC, que codifica a subunidade estrutural do flagelo, pois, anteriormente, havia sido demonstrado que essa estrutura contribui para adesão e invasão celular dessa cepa. Para os ensaios de polimerização de actina por fluorescência foram utilizadas células HeLa, nos tempos de 2 h, 3 h e 6 h, e para o livecell imaging foram utilizadas células HeLa transformadas com GFP durante 2 h. Foi também realizado o sequenciamento das cepas aEPEC 1711-4 e E. albertii 1551-2 e análise de proteínas secretadas para posterior análise. Resultados: Observou-se que, para ambas as cepas estudadas, a quantidade de bactérias aderidas sobre células Caco-2 aumentou até 3 h de contato (aproximadamente 105 UFC/mL), mantendo-se constante entre 3 h e 6 h. Para ambas as cepas, o processo de invasão iniciou-se próximo às 3 h de contato com essas células (0,2% do total de bactérias associadas para aEPEC 1711-4 e 0,02% para E. albertii 1551-2). A expressão do gene eae (que codifica intimina) na aEPEC 1711-4 aumentou progressivamente até 6 h de contato, enquanto a expressão dos outros genes representativos de LEE e fliC mantiveram-se constantes. Por sua vez, a E. albertii 1551-2 não apresentou alteração na expressão dos genes estudados em até 6 h de interação. Durante a persistência intracelular, a expressão dos genes estudados manteve-se constante na aEPEC 1711-4, enquanto para a E. albertii, observou-se aumento de pelo menos 8 vezes da expressão desses genes. A análise de genoma da cepa 1551-2 identificou a presença de 31 efetores dependentes do SST3, dentre eles uma variante de TccP2/EspFu2. Conclusão: O SST3 está associado a processos de adesão, colonização, invasão e persistência intracelular nas cepas de aEPEC e E. albertii estudadas, sendo a expressão de cada operon distinta entre elas, indicando que outros reguladores transcricionais e/ou pós-transcricionais poderiam contribuir para as diferenças observadas.