Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de tripsina presente no mosquito Aedes aegypti
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Data de Publicação: | 2010 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UNIFESP |
Texto Completo: | http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9205 |
Resumo: | O mosquito Ae. aegypti é o vetor clássico da febre amarela e do dengue. Em insetos hematófagos, a digestão do sangue é realizada por enzimas proteolíticas, que também podem estar envolvidas na relação parasita-vetor. O processo de alimentação com sangue requer que os artrópodes hematófagos sejam capazes de inibir as defesas hemostáticas do hospedeiro, como por exemplo, com a presença de inibidores das enzimas da cascata da coagulação. Com a finalidade de conhecer melhor sobre a biologia do vetor do dengue, o objetivo deste trabalho foi a expressão e a caracterização de um inibidor de serinoproteases do tipo Kazal presente em mosquito Ae. aegypti. Para isso, o inibidor recombinante (rAaTI) e sua forma truncada rAaTIΔ (sem a região C-terminal) foram expressos em sistema Pichia pastoris e purificados por cromatografia de afinidade. O rAaTI purificado foi capaz de inibir a atividade amidolítica da tripsina, plasmina e fracamente a trombina. O rAaTI foi também capaz de prolongar o tempo de coagulação, e há indícios que o inibidor se ligue em alguma região ocupada pela heparina ou pela anitrombina III. O análise do transcrito mostrou que o AaTI está presente na glândula salivar e em intestino de fêmeas 3 e 24 h após a alimentação com sague, e também em todos os estádios larvais, em pupa e em machos, o que sugere que este inibidor possa ter outras funções no desenvolvimento do mosquito. O rAaTI ainda foi capaz de inibir fortemente as tripsinas de larva de 4° instar, e tripsina de fêmeas 24 h após a alimentação, sugerindo que também possa estar envolvido com a modulação destas enzimas na fase larval e no final da digestão com sangue. |
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Watanabe, Renata Midori Okuta [UNIFESP]Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]2015-07-22T20:49:43Z2015-07-22T20:49:43Z2010-02-24WATANABE, Renata Midori Okuta. Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de tripsina presente no mosquito Aedes aegypti. 2010. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2010.http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9205Publico-204.pdfO mosquito Ae. aegypti é o vetor clássico da febre amarela e do dengue. Em insetos hematófagos, a digestão do sangue é realizada por enzimas proteolíticas, que também podem estar envolvidas na relação parasita-vetor. O processo de alimentação com sangue requer que os artrópodes hematófagos sejam capazes de inibir as defesas hemostáticas do hospedeiro, como por exemplo, com a presença de inibidores das enzimas da cascata da coagulação. Com a finalidade de conhecer melhor sobre a biologia do vetor do dengue, o objetivo deste trabalho foi a expressão e a caracterização de um inibidor de serinoproteases do tipo Kazal presente em mosquito Ae. aegypti. Para isso, o inibidor recombinante (rAaTI) e sua forma truncada rAaTIΔ (sem a região C-terminal) foram expressos em sistema Pichia pastoris e purificados por cromatografia de afinidade. O rAaTI purificado foi capaz de inibir a atividade amidolítica da tripsina, plasmina e fracamente a trombina. O rAaTI foi também capaz de prolongar o tempo de coagulação, e há indícios que o inibidor se ligue em alguma região ocupada pela heparina ou pela anitrombina III. O análise do transcrito mostrou que o AaTI está presente na glândula salivar e em intestino de fêmeas 3 e 24 h após a alimentação com sague, e também em todos os estádios larvais, em pupa e em machos, o que sugere que este inibidor possa ter outras funções no desenvolvimento do mosquito. O rAaTI ainda foi capaz de inibir fortemente as tripsinas de larva de 4° instar, e tripsina de fêmeas 24 h após a alimentação, sugerindo que também possa estar envolvido com a modulação destas enzimas na fase larval e no final da digestão com sangue.The Aedes aegypti mosquito is the classic vector of yellow fever and dengue fever. In haematophagous insects, blood digestion is carried out by proteolitic enzymes, which can also be envolved in parasite-vector relationship. Blood feeding requires that haematophagous insects are able to inhibit host hemostatic defenses, containing inhibitors of coagulation cascade enzymes, for example. In order to understand the vector bilogy, the aim of this work was expression and characterization of a Kazal-type serine protease inhibitor present in Aedes aegypti mosquito. Recombinant inhibitor (rAaTI) and its truncated form rAaTIΔ (without Cterminal region) were expressed in Pichia pastoris system and purified by affinity chromatography. Purified rAaTI was able to inhibit amidolytic activity of trypsin, plasmin and weakly inhibited thrombin. rAaTI was also able to prolong coagulation time, and there are evidences that inhibitor bind in some region occupied by heparin or antithrombin III. Transcription analyzes showed that AaTI is present in salivary gland and midgut of females 3 and 24 h after blood feeding, and in all larval instars, pupae and males, which suggest that inhibitor may have other functions in mosquito development. rAaTI was also able to strongly inhibit trypsin from 4th instar lavae , and female trypsin 3 and 34 h after blood feeding, suggesting that rAaTI may be involved in trypsin modulation in larval phase and in the end of blood difgestion.TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertações120 p.porUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Blood coagulationDigestionInhibitorsSerine ProteasesAedesCoagulaçãoDigestãoInibidoresSerinoproteasesAedes aegyptiClonagem, expressão e caracterização de um inibidor de tripsina presente no mosquito Aedes aegyptiCloning, expression and characterization of a trypsin inhibitor from Aedes aegypti mosquitoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UNIFESPinstname:Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)instacron:UNIFESPSão Paulo, Escola Paulista de Medicina (EPM)Ciências Biológicas (Biologia Molecular) - EPMORIGINALPublico-204.pdfapplication/pdf1677799${dspace.ui.url}/bitstream/11600/9205/1/Publico-204.pdf7f10174cddd62a0a9683b2af760805d8MD51open accessTEXTPublico-204.pdf.txtPublico-204.pdf.txtExtracted texttext/plain202841${dspace.ui.url}/bitstream/11600/9205/3/Publico-204.pdf.txtffb27eaf5ac2516feddace668d0b2680MD53open accessTHUMBNAILPublico-204.pdf.jpgPublico-204.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg3858${dspace.ui.url}/bitstream/11600/9205/5/Publico-204.pdf.jpged0a2e7b8692d8757983f151a4543d77MD55open access11600/92052022-07-29 20:13:51.606open accessoai:repositorio.unifesp.br:11600/9205Repositório InstitucionalPUBhttp://www.repositorio.unifesp.br/oai/requestopendoar:34652023-05-25T12:12:16.379837Repositório Institucional da UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)false |
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