Expressão gênica de células da córnea submetidas à infecção por acanthamoeba Spp

• Autor(a) principal: Sant'Ana, Viviane Peracini [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=6743041; https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/52869
• topic: Acanthamoeba; Ceratite; Exoproteoma; Acanthamoeba; Exoproteome; Keratitis

Objetivo: O presente projeto de pesquisa se propôs: 1) Analisar a degradação proteolítica dos principais substratos presentes na córnea (colágeno, fibronectina, laminin e tubulina) com o exoproteoma de Acanthamoeba spp; 2) Analisar a citotoxicidade do exoproteoma de Acanthamoeba spp em células HUVEC em 11 isolados clínicos assim como identificar seu principal mecanismo de indução de morte celular; 3) Identificar o exoproteoma Acanthamoeba spp através da purificação com benzamidinesepharose da classe de serino protease; 4) Caracterizar o exoproteoma de Acanthamoeba spp em diferentes pHs e temperaturas; 5) Analisar a susceptibilidade do exoproteoma de Acanthamoeba spp às diamidinas aos inibidores enzimáticos. Métodos: Foram obtidas culturas primárias de trofozoítos por meio do raspado de córnea de pacientes com ceratite por Acanthamoeba spp. A análise do exoproteoma de Acanthamoeba spp foi realizada por método de zimografia (SDSPAGEgelatina), o gel de poliacrilamida com 0,01 % de gelatina foi preparado de acordo com as subunidades de seus substratos: Fibronectina, Laminina e Tubulina. As células HUVECs foram cultivadas em estufa úmida na temperatura de 37°C a 5% CO2, no meio de cultura RPMI com suplemento de 10% de soro fetal bovino. O ensaio de proteólise da molécula de colágeno tipo I, foi obtido pela hidrólise do colágeno tipo I, na concentração de uso de 0.4 mg/ ml, previamente dialisado em tampão específico (TrisHCl 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM). Para a análise da caracterização do exoproteoma de Acanthamoeba spp em diferentes tampões de pHs e em diferentes temperaturas cada isolado clínico foi retirado do gel e colocado em diferentes pHs (pHs 2.0 – 12.0). As diamidinas utilizadas foram Brolene 0,1% e Désomédine 0,1%. Também foram utilizados inibidores enzimáticos PMSF 0,1 M e Trasylol 215 μM. Resultados: O perfil proteolítico do exoproteoma de Acanthamoeba spp está associado com gravidade da infecção observada no paciente. A degradação de colágeno tipo I pelo exoproteoma de Acanthamoeba spp os resultados laboratoriais corroboram com o aspecto clínico observado nos pacientes portadores de ceratite amebiana moderada e grave. No ensaio de citotoxicidade, o presente estudo (in vitro do exoproteoma de Acanthamoeba spp com HUVEC) mostrou a independência de contato do trofozoíto na indução da morte celular por apoptose. Os ensaios protéicos in vitro, cujos resultados prospectam aos mecanismos de expressão gênica em linhagens celulares da córnea, demonstraram o aspecto funcional dos diferentes exoproteomas amebianos associado à cicatrização e regeneração, cujos processos são mediados principalmente via sinalização celular no hospedeiro. A cromatografia de afinidade demonstrou a prevalência de enzimas proteolíticas da classe das serinoproteases contidas no exoproteoma do protozoário. Nos ensaios de proteólise do exoproteoma de Acanthamoeba spp em diferentes condições de pH e diferentes temperaturas observouse forte resistência do composto proteico a diferentes condições de pHs e temperaturas onde foram avaliados no período de 4 e 16 horas, onde a temperatura ótima foi de 35°C e 37°C no pH 7.0 condições apropriadas para a patofisiologia da ceratite amebiana. Quanto ao experimento com as diamidinas, verificouse, ao contrário da propamidina, a hexamidina não foi capaz de inibir totalmente a atividade enzimática do exoproteoma. Conclusões: O presente estudo indica que o exoproteoma produzido por trofozoítos de Acanthamoeba spp consiste de grande diversidade de enzimas, com ênfase às enzimas pertencentes à classe das serinoproteases. A atividade enzimática contida nos diferentes exoproteomas amebianos sugere influência relevante sobre os mecanismos de expressão gênica, com ênfase à produção de compostos de matriz extracelular pelas células da córnea. Os exoproteomas apresentou padrão de resistência física e química associado à atividade enzimática. Os constituintes enzimáticos de diferentes exoproteomas amebianos expressam proteínas capazes de degradar as principais glicoproteínas e colágeno tipo I presentes na córnea, além de induzir a morte celular por apoptose, independente de contato direto do trofozoíto. O isolamento laboratorial seguido da análise do exoproteoma amebiano demonstra a importância da pesquisa translacional associada ao presente estudo, uma vez que os constituintes enzimáticos secretados pelo protozoário podem induzir à morte celular e interferir na síntese de compostos de matriz extracelular vinculados aos processos de cicatrização e regeneração tecidual. Consequentemente, mecanismos associados à expressão gênica em células epiteliais e ceratócitos podem ser inativados, prospectando piora no quadro clínico do paciente.