Análise de aneuploidia em Trypanosoma cruzi pela técnica de FISH (“Fluorescence In Situ Hybridization”)

• Autor(a) principal: Lucas, Isabella Rios [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://repositorio.unifesp.br/11600/68026
• topic: FISH; Aneuploidia; Trypanosoma cruzi

O protozoário parasita Trypanosoma cruzi possui características marcantes de variabilidade genética que podem desempenhar um papel importante na adaptação do parasita às mudanças ambientais durante seu ciclo de vida, incluindo resistência às drogas em hospedeiros mamíferos. Embora o T. cruzi tenha sido considerado um organismo diploide, análises por hibridização genômica comparativa e sequenciamento genômico de nova geração mostraram a presença de aneuploidia segmentar (perda ou ganho de um fragmento cromossômico) e aneuploidia cromossômica (cromossomos com diferentes somia) em uma mesma população de parasitas. A aneuploidia pode constituir-se em uma fonte de variabilidade genética em T. cruzi, organismo que se reproduz assexuadamente e apresenta evolução predominantemente clonal. Nós investigamos o nível de aneuploidia em T. cruzi por hibridização fluorescente in situ (FISH), que permite a avaliação da ploidia no nível de célula única. Nós selecionamos os genes H49 e JL8 como marcadores cromossomo-específicos, presentes em cópia única no cromossomo TcChr39 do clone CL Brener. Os genes H49 e JL8 codificam antígenos repetitivos portadores de repetições de aminoácidos arranjadas em tandem. As regiões centrais dos genes H49 e JL8 compreendem grande número de repetições em tandem que podem atuar como alvo adequado para hibridação de DNA. A ploidia foi estimada em aproximadamente 600 células marcadas para cada sonda em triplicata por 2 observadores independentes. Células com duplo flagelo e/ou dois cinetoplastos (células mitóticas) foram excluídas da análise. Os níveis de ploidia também foram confirmados por microscopia confocal e em parasitas coletados na fase G1 do ciclo celular após sincronização com hidroxiureia. Variações no número de cópias dos genes H49 e JL8 foram identificadas em uma mesma população de parasitas produzindo subpopulações de células com diferentes ploidia. A distribuição do número de cópias do gene H49 por célula foi a seguinte: 26,3% das células têm uma cópia do gene H49 (haploide), 41,1% têm duas cópias (diploide) e 16,7% têm três cópias (triploide). Em relação ao gene JL8, 39,2% das células possuem apenas uma cópia do gene JL8, 35,1% possuem duas cópias e 10,6% possuem três cópias. A origem de células haploides para os genes H49 ou JL8 poderia ser explicada pela deleção do gene por “crossing over” desigual entre cromátides irmãs na mitose, resultando em aneuploidia segmentar. A célula triploide poderia ser resultante de erro na segregação cromossômica na mitose por não disjunção do cromossomo TcChr39. A ocorrência de células haploides para os genes H49 e JL8 também pode ser explicada pela falha das cromátides TcChr39 em se separar durante e após a mitose. As variações do número de cópias dos genes H49 e JL8 entre as células de uma mesma população podem produzir mosaicismo cromossômico e heterogeneidade intra-cepa em T. cruzi. Para testar as hipóteses acima, nós estamos trabalhando com FISH de duas cores no cromossomo TcCh39 usando as sondas H49 e JL8.