Caracterização funcional de proteases e inibidores do carrapato rhipicephalus microplus e do parasita babesia bovis

• Autor(a) principal: Lu, Stephen [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=7724153; https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/59677
• topic: B. Bovis; R. Microplus; Inibidores; Proteases; B. Bovis; R. Microplus; Inibidores; Proteases

Objetivo: Caracterizar uma serino peptidase semelhante à subtilisina, uma aspartil e uma cisteíno peptidase do parasita Babesia bovis, além de um novo inibidor do tipo cistatina do carrapato R. microplus. Materiais e métodos: Realizamos uma busca no genoma de B. bovis e selecionamos três peptidases para este estudo: uma serino peptidase semelhante à subtilisina (XP_001610126) (BbSp), uma aspartil peptidase (BBOV_IV007890) (BbAsp) e uma cisteíno peptidase (XP_001612131) (BbCp). As proteases recombinantes foram obtidas utilizando diferentes sistemas de expressão (bactérias, leveduras ou células de insetos) e purificadas. Os anticorpos produzidos em coelhos ou camundongos foram utilizados em ensaios de neutralização do crescimento de B. bovis in vitro. Após ensaios de refolding a BbCp foi obtida de forma ativa e, portanto, determinamos sua específicidade com o uso de uma biblioteca de peptídeos em phage display, além de avaliar sua atividade proteolítica na presença de diferentes cistatinas de R. microplus. Em paralelo, realizamos a clonagem, expressão e purificação de uma nova cistatina do tipo 1 de R. microplus. Resultados: Inicialmente foram realizados testes de expressão da BbSp em diferentes sistemas (bactérias, leveduras e células de inseto), sem sucesso. Desta forma uma porção da região N-terminal, predita potencialmente imunogênica, foi selecionada e obtida em bactérias. O soro contendo anticorpos contra a porção N-terminal da BbSp foi capaz de interferir no crescimento de B. bovis in vitro, com redução de 32% da parasitemia na cultura quando comparada ao grupo controle. Em paralelo, a BbAsp recombinante foi obtida utilizando o sistema de expressão de células de inseto. O tratamento de culturas de B. bovis com anticorpos anti-BbAsp resultou em redução de 61% da parasitemia. A enzima BbCp foi obtida nos corpos de inclusão de bactérias, sendo solubilizada na presença de ureia 8 M. A BbCp recombinante purificada se apresentou como uma banda proteíca de 37 kDa e, após o refolding, como uma banda de 25 kDa. Como outras cisteíno peptidase, a rBbCp apresentou pH ótimo entre 6,5 – 7,0, aumento da atividade proteolítica na presença de um agente redutor (30 vezes com DTT 1 mM), preferência pelos resíduos Ser>Pro>Val>Leu>Phe na posição P2 e foi completamente inibida na presença de E64. Além disso, a BbCp recombinante também foi inibida por cistatinas do R. microplus, como a Bmcystatin-1 (Ki = 2,89 nM) e a Rmcystatin-3 (Ki = 0,13 nM). Anticorpos anti-BbCp também foram capazes de interferir no crescimento de B. bovis in vitro e observamos redução de 32% de células infectadas em relação ao grupo controle. R. microplus de campo apresentaram modulação da expressão de 3 cistatinas (Bmcystatin-1, Rmcystatin-1b e Rmcystatin-4) no intestino dos animais infectados por B. bovis. xix Os transcritos da Rmcystatin-1b foram encontrados no intestino de carrapatos parcialmente (65 vezes maior em relação as glândulas salivares) ou completamente alimentados (40 vezes maior em relação aos hemócitos), sendo modulados negativamente durante os 3 primeiros dias após a queda. O inibidor recombinante foi obtido em bactérias e após sua purificação apresentou atividade inibitória contra diferentes cisteíno peptidases, como BmCL-1 (Ki = 0,013 nM), papaína (Ki = 0,72 nM), catepsina L humana (Ki = 0,41 nM), catepsina B humana (Ki = 6,27 nM) e rBbCp (Ki = 7,48 nM). O inibidor recombinante também inibiu parcialmente a atividade proteolítica presente no intestino de R. microplus 48 h pós-queda, além de interferir no crescimento de B. bovis in vitro, reduzindo em aproximadamente 50% a parasitemia quando comparado ao controle. Conclusão: Apesar das diferentes condições testadas, não foi possível obter a BbSp e a BbAsp ativas. Por outro lado, a BbCp recombinante apresentou propriedades cinéticas comuns às cisteíno peptidases. Os ensaios de neutralização de B. bovis, utilizando soro contra as peptidases de interesse, sugerem seu possível envolvimento durante a invasão ou egresso de eritrócitos bovinos. Os resultados da Rmcystatin-1b cuja localização encontra-se majoritária no intestino de carrapatos somados a sua modulação durante os primeiros dias pós-queda e a sua capacidade de inibir cisteíno peptidases nativas do R. microplus sugerem seu possível papel como um regulador da digestão em carrapatos. A Rmcystatin-1b também apresentou atividade inibitória contra a BbCp, além de interferir no crescimento de B. bovis in vitro. Com base nesses resultados especulamos que a interação das peptidases de B. bovis com os inibidores de R. microplus deve contribuir para a interação parasita-hospedeiro.