Estudo do envolvimento da atividade catalítica e dos mecanismos de internalização da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de crotalus durissus terrificus sobre a expressão de ciclooxigenase-2, do receptor de FLA2 e da proliferação de mioblastos C2C12
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2022 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UNIFESP |
Texto Completo: | https://repositorio.unifesp.br/11600/68701 |
Resumo: | A fosfolipase A2 secretada (sFLA2) isolada do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus, denominada Crotoxina B (CB), além de ser neurotóxica, também é responsável pelo efeito miotóxico do veneno. Apesar deste conhecimento, um estudo recente de nosso grupo mostrou que, em concentração nãocitotóxica, a CB induz a proliferação de células miogênicas por mecanismos dependentes da via de ciclooxigenase2 (COX-2). Contudo, os mecanismos envolvidos na modulação da via COX-2 e proliferação de mioblastos ainda são desconhecidos. Estes efeitos podem ser consequência do modo de interação com receptores ou aceptores da CB com as células miogênicas que culmine na sua internalização, para estimular as repostas biológicas observadas. Hipotetizamos que estes efeitos sejam decorrentes da modulação dessa sFLA2 sobre o receptor tipo M de sFLA2 (RFLA2), expresso no tecido muscular e pela interação com FLA2 intracelulares, como a FLA2 citosólica (cFLA2). Desse modo, o objetivo deste trabalho é a investigação da interação da CB em mioblastos C2C12, por meio de sua atividade catalítica e possível internalização citoplasmática, e influência destes eventos sobre a modulação da proliferação celular, expressão de COX-2 e expressão do RFLA2. Os mioblastos C2C12 foram incubados com CB 0,16 µM na presença do composto CNF (inibidor da atividade catalítica 50µg/µL), ou Dynasore (inibidor de endocitose via clatrina – 40 µM), ou CAY10502 (inibidor cFLA2 – 0,025 µM), e as células foram analisadas quanto à expressão de COX-2 por western blotting. Os dados preliminares mostraram que a indução da expressão de COX-2 ocorre por mecanismos dependentes da atividade catalítica da CB, bem como pela interação desta sFLA2 com domínios de membrana que ativam endocitose como a clatrina e pela ação conjunta à ativação da cFLA2. Para a análise da modulação da expressão proteica do RFLA2 os mioblastos C2C12 foram incubados com CB 0,16 µM na presença do composto CNF (inibidor da atividade catalítica 50µg/µL), ou CAY10502 (inibidor cFLA2 – 0,025 µM) ou Lumiracoxibe (inibidor seletivo da COX-2, 100 µM), Valeril salicilato (inibidor seletivo da COX-1, 350 µM) ou irIL6 (inibidor do receptor de IL6 – 0,2 µg/mL). As células foram analisadas quanto à expressão de RFLA2 por western blotting e quantificação de IL6 no sobrenadante por enzimaimunoensaio. Os dados obtidos mostraram pela primeira vez que, em concentração não citotóxica, a CB é capaz de induzir o RFLA2 em mioblastos em proliferação, de forma dependente da atividade catalítica, da cFLA2 e da COX-2, mas não da via COX-1. Ainda, a expressão do RFLA2 parece ser modulada pela interação da IL-6 com seu receptor específico. A produção desta mioquina pela CB, é modulada positivamente pela atividade catalítica da CB, e pelas vias COX-1 e COX-2. |
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Viana, Natalia Agnes Almeida [UNIFESP]http://lattes.cnpq.br/4758285309274712http://lattes.cnpq.br/1310560200014128Moreira, Vanessa [UNIFESP]São Paulo2023-07-20T13:43:48Z2023-07-20T13:43:48Z2022-12-09VIANA, Natália Agnes Almeida. Estudo do envolvimento da atividade catalítica e dos mecanismos de internalização da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre a expressão de ciclooxigenase-2, do receptor de FLA2 e da proliferação de mioblastos C2C12. 2023. 64 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2023.https://repositorio.unifesp.br/11600/68701A fosfolipase A2 secretada (sFLA2) isolada do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus, denominada Crotoxina B (CB), além de ser neurotóxica, também é responsável pelo efeito miotóxico do veneno. Apesar deste conhecimento, um estudo recente de nosso grupo mostrou que, em concentração nãocitotóxica, a CB induz a proliferação de células miogênicas por mecanismos dependentes da via de ciclooxigenase2 (COX-2). Contudo, os mecanismos envolvidos na modulação da via COX-2 e proliferação de mioblastos ainda são desconhecidos. Estes efeitos podem ser consequência do modo de interação com receptores ou aceptores da CB com as células miogênicas que culmine na sua internalização, para estimular as repostas biológicas observadas. Hipotetizamos que estes efeitos sejam decorrentes da modulação dessa sFLA2 sobre o receptor tipo M de sFLA2 (RFLA2), expresso no tecido muscular e pela interação com FLA2 intracelulares, como a FLA2 citosólica (cFLA2). Desse modo, o objetivo deste trabalho é a investigação da interação da CB em mioblastos C2C12, por meio de sua atividade catalítica e possível internalização citoplasmática, e influência destes eventos sobre a modulação da proliferação celular, expressão de COX-2 e expressão do RFLA2. Os mioblastos C2C12 foram incubados com CB 0,16 µM na presença do composto CNF (inibidor da atividade catalítica 50µg/µL), ou Dynasore (inibidor de endocitose via clatrina – 40 µM), ou CAY10502 (inibidor cFLA2 – 0,025 µM), e as células foram analisadas quanto à expressão de COX-2 por western blotting. Os dados preliminares mostraram que a indução da expressão de COX-2 ocorre por mecanismos dependentes da atividade catalítica da CB, bem como pela interação desta sFLA2 com domínios de membrana que ativam endocitose como a clatrina e pela ação conjunta à ativação da cFLA2. Para a análise da modulação da expressão proteica do RFLA2 os mioblastos C2C12 foram incubados com CB 0,16 µM na presença do composto CNF (inibidor da atividade catalítica 50µg/µL), ou CAY10502 (inibidor cFLA2 – 0,025 µM) ou Lumiracoxibe (inibidor seletivo da COX-2, 100 µM), Valeril salicilato (inibidor seletivo da COX-1, 350 µM) ou irIL6 (inibidor do receptor de IL6 – 0,2 µg/mL). As células foram analisadas quanto à expressão de RFLA2 por western blotting e quantificação de IL6 no sobrenadante por enzimaimunoensaio. Os dados obtidos mostraram pela primeira vez que, em concentração não citotóxica, a CB é capaz de induzir o RFLA2 em mioblastos em proliferação, de forma dependente da atividade catalítica, da cFLA2 e da COX-2, mas não da via COX-1. Ainda, a expressão do RFLA2 parece ser modulada pela interação da IL-6 com seu receptor específico. A produção desta mioquina pela CB, é modulada positivamente pela atividade catalítica da CB, e pelas vias COX-1 e COX-2.Phospholipase A2 (sPLA2) isolated from the snake venom Crotalus durissus terrificus, known as Crotoxin B (CB), in addition to being neurotoxic, is also responsible for the myotoxic effect of the venom. Despite this, a recent study by our group showed that the CB stimulates the proliferation of myogenic cells, or myoblasts, by mechanisms dependent on the cyclooxygenase2 (COX2) pathway. However, the mechanisms involved in the modulation of the COX2 pathway and myoblast proliferation are still unknown. These effects could be a result of the interaction of myogenic cells with CB receptors or acceptors, which leads to their internalization and triggers the observable biological reactions. We propose that these effects are the result of sPLA2's modulation of the muscleexpressed Mtype sPLA2 receptor (RPLA2) and its interaction with intracellular PLA2 such as cytosolic PLA2 (cPLA2). The objective is to investigate the interaction of CB in C2C12 myoblasts, through its catalytic activity and possible cytoplasmic internalization, and the influence of these events on the modulation of cell proliferation, COX2 expression and RFLA2 expression.For this purpose, C2C12 myoblasts were incubated with 0.16 μM CB in the presence of the compound CNF (inhibitor of catalytic activity 50μg/ μL), or Dynasore (inhibitor of endocytosis via clathrin – 40 μM), or CAY10502 (cPLA2 inhibitor – 0.025 μM). Cells were analyzed for COX2 expression by western blotting. Preliminary data showed that the induction of COX2 expression occurs by mechanisms dependent on the catalytic activity of CB, as well as by the interaction of sPLA2 with membrane domains that activate endocytosis such as clathrin and by the joint action with the activation of cPLA2. For the analysis of the modulation of RFLA2 protein expression, C2C12 myoblasts were incubated with 0.16 μM CB in the presence of CNF compound (inhibitor of catalytic activity 50μg/ μL), or CAY10502 (cPLA2 inhibitor – 0.025 μM) or Lumiracoxib (selective COX2 inhibitor, 100 μM), Valeryl salicylate (selective COX1 inhibitor, 350 μM) or irIL6 (IL6 receptor inhibitor – 0.2 μg/mL). Cells were analyzed for RPLA2 expression by western blotting and quantification of IL6 in the supernatant by enzyme immunoassay. The data showed for the first time that CB, in noncytotoxic concentration, is capable of inducing RPLA2 in proliferating myoblasts, dependent of catalytic activity, cPLA2 and COX2, and not dependent of the COX1 pathway. Furthermore, RPLA2 expression seems to be modulated by the interaction of IL6 with its specific receptor. The production of this myokine by CB is positively modulated by the catalytic activity of CB, and by the COX1 and COX2 pathways.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)64 f.porUniversidade Federal de São PauloFosfolipase A2 miotóxicaReceptor de fosfolipase A2Veneno de serpente Crotalus durissus terrificusMioblastosEstudo do envolvimento da atividade catalítica e dos mecanismos de internalização da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de crotalus durissus terrificus sobre a expressão de ciclooxigenase-2, do receptor de FLA2 e da proliferação de mioblastos C2C12Study of the involvement of the catalytic activity and the internalization mechanisms of phospholipase A2 (FLA2) isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus on the expression of cyclooxygenase-2, of the FLA2 receptor and the proliferation of C2C12 myoblastsinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UNIFESPinstname:Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)instacron:UNIFESPEscola Paulista de Medicina (EPM)FarmacologiaFarmacologiaFarmacologia da InflamaçãoLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-86011${dspace.ui.url}/bitstream/11600/68701/2/license.txt9e799f16cd3b4c67c11b00e9d3bd25c8MD52open accessTEXTTESE - NATÁLIA AGNES ALMEIDA.pdf.txtTESE - NATÁLIA AGNES ALMEIDA.pdf.txtExtracted texttext/plain157487${dspace.ui.url}/bitstream/11600/68701/6/TESE%20-%20NAT%c3%81LIA%20AGNES%20ALMEIDA.pdf.txt7b9647d36bda79bc60c37c1d2d2fba12MD56open accessTHUMBNAILTESE - NATÁLIA AGNES ALMEIDA.pdf.jpgTESE - NATÁLIA AGNES ALMEIDA.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg4641${dspace.ui.url}/bitstream/11600/68701/8/TESE%20-%20NAT%c3%81LIA%20AGNES%20ALMEIDA.pdf.jpg2f901c0cc60a8e6ee188ed0a1d1ce6b8MD58open accessORIGINALTESE - NATÁLIA AGNES ALMEIDA.pdfTESE - NATÁLIA AGNES ALMEIDA.pdfDissertação de Mestradoapplication/pdf862588${dspace.ui.url}/bitstream/11600/68701/1/TESE%20-%20NAT%c3%81LIA%20AGNES%20ALMEIDA.pdff85f6cd49cbfd57138fee5e55840aa23MD51open access11600/687012023-07-25 08:15:59.654open 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Estudo do envolvimento da atividade catalítica e dos mecanismos de internalização da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de crotalus durissus terrificus sobre a expressão de ciclooxigenase-2, do receptor de FLA2 e da proliferação de mioblastos C2C12 |
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Study of the involvement of the catalytic activity and the internalization mechanisms of phospholipase A2 (FLA2) isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus on the expression of cyclooxygenase-2, of the FLA2 receptor and the proliferation of C2C12 myoblasts |
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Estudo do envolvimento da atividade catalítica e dos mecanismos de internalização da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de crotalus durissus terrificus sobre a expressão de ciclooxigenase-2, do receptor de FLA2 e da proliferação de mioblastos C2C12 |
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Estudo do envolvimento da atividade catalítica e dos mecanismos de internalização da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de crotalus durissus terrificus sobre a expressão de ciclooxigenase-2, do receptor de FLA2 e da proliferação de mioblastos C2C12 Viana, Natalia Agnes Almeida [UNIFESP] Fosfolipase A2 miotóxica Receptor de fosfolipase A2 Veneno de serpente Crotalus durissus terrificus Mioblastos |
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Estudo do envolvimento da atividade catalítica e dos mecanismos de internalização da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de crotalus durissus terrificus sobre a expressão de ciclooxigenase-2, do receptor de FLA2 e da proliferação de mioblastos C2C12 |
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Estudo do envolvimento da atividade catalítica e dos mecanismos de internalização da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de crotalus durissus terrificus sobre a expressão de ciclooxigenase-2, do receptor de FLA2 e da proliferação de mioblastos C2C12 |
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Estudo do envolvimento da atividade catalítica e dos mecanismos de internalização da fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de crotalus durissus terrificus sobre a expressão de ciclooxigenase-2, do receptor de FLA2 e da proliferação de mioblastos C2C12 |
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Fosfolipase A2 miotóxica Receptor de fosfolipase A2 Veneno de serpente Crotalus durissus terrificus Mioblastos |
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A fosfolipase A2 secretada (sFLA2) isolada do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus, denominada Crotoxina B (CB), além de ser neurotóxica, também é responsável pelo efeito miotóxico do veneno. Apesar deste conhecimento, um estudo recente de nosso grupo mostrou que, em concentração nãocitotóxica, a CB induz a proliferação de células miogênicas por mecanismos dependentes da via de ciclooxigenase2 (COX-2). Contudo, os mecanismos envolvidos na modulação da via COX-2 e proliferação de mioblastos ainda são desconhecidos. Estes efeitos podem ser consequência do modo de interação com receptores ou aceptores da CB com as células miogênicas que culmine na sua internalização, para estimular as repostas biológicas observadas. Hipotetizamos que estes efeitos sejam decorrentes da modulação dessa sFLA2 sobre o receptor tipo M de sFLA2 (RFLA2), expresso no tecido muscular e pela interação com FLA2 intracelulares, como a FLA2 citosólica (cFLA2). Desse modo, o objetivo deste trabalho é a investigação da interação da CB em mioblastos C2C12, por meio de sua atividade catalítica e possível internalização citoplasmática, e influência destes eventos sobre a modulação da proliferação celular, expressão de COX-2 e expressão do RFLA2. Os mioblastos C2C12 foram incubados com CB 0,16 µM na presença do composto CNF (inibidor da atividade catalítica 50µg/µL), ou Dynasore (inibidor de endocitose via clatrina – 40 µM), ou CAY10502 (inibidor cFLA2 – 0,025 µM), e as células foram analisadas quanto à expressão de COX-2 por western blotting. Os dados preliminares mostraram que a indução da expressão de COX-2 ocorre por mecanismos dependentes da atividade catalítica da CB, bem como pela interação desta sFLA2 com domínios de membrana que ativam endocitose como a clatrina e pela ação conjunta à ativação da cFLA2. Para a análise da modulação da expressão proteica do RFLA2 os mioblastos C2C12 foram incubados com CB 0,16 µM na presença do composto CNF (inibidor da atividade catalítica 50µg/µL), ou CAY10502 (inibidor cFLA2 – 0,025 µM) ou Lumiracoxibe (inibidor seletivo da COX-2, 100 µM), Valeril salicilato (inibidor seletivo da COX-1, 350 µM) ou irIL6 (inibidor do receptor de IL6 – 0,2 µg/mL). As células foram analisadas quanto à expressão de RFLA2 por western blotting e quantificação de IL6 no sobrenadante por enzimaimunoensaio. Os dados obtidos mostraram pela primeira vez que, em concentração não citotóxica, a CB é capaz de induzir o RFLA2 em mioblastos em proliferação, de forma dependente da atividade catalítica, da cFLA2 e da COX-2, mas não da via COX-1. Ainda, a expressão do RFLA2 parece ser modulada pela interação da IL-6 com seu receptor específico. A produção desta mioquina pela CB, é modulada positivamente pela atividade catalítica da CB, e pelas vias COX-1 e COX-2. |
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