Nanopartículas de sílica mesoporosa quimicamente modificadas para transfecção com DNA plasmidial

• Autor(a) principal: Crapina, Laura Cipriano [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/57430
• topic: Terapia gênica; Vetor não viral; Nanopartículas; Sílica mesoporosa; DNA plasmidial; Gene therapy; Non-viral vector; Nanoparticles; Mesoporous silica; Plasmid DNA

A terapia gênica regula a expressão de um gene terapêutico pela transferência de ácidos nucleicos para o interior das células alvo. No entanto, os ácidos nucleicos por si só apresentam dificuldades em penetrar a membrana celular, necessitando de vetores para realizar tal entrega. Vírus de replicação incompetente são vetores que possibilitam a expressão transiente ou permanente de genes com alta eficiência, porém apresentam riscos relacionados à biossegurança e alto custo de produção. Em contrapartida, os vetores não virais são mais seguros e baratos de produzir, mas ainda ineficientes. Nesse contexto, nanopartículas de sílica mesoporosa (NPSM) têm sido consideradas como uma das plataformas promissoras para a entrega de vetores não virais por possuírem propriedades singulares, como: grande área superficial, extensa rede de poros de tamanhos ajustáveis, propriedades químicas de superfície de fácil modificação, além de biocompatibilidade e degradabilidade. Neste estudo, as NPSM foram preparadas pela hidrólise básica do tetraetilortossilicato e posterior condensação na presença de direcionadores estruturais baseados em agregados micelares de um surfactante catiônico. Após a remoção do molde as nanopartículas foram modificadas com alquilaminossilanos, que continham na cadeia alquílica um, dois ou três grupos amino, para adquirir a capacidade de transportar DNA plasmidial (pDNA), sendo a eficiência de transfecção avaliada em diferentes linhagens celulares. As nanopartículas produzidas apresentaram, formato esférico, com diâmetro ao redor de 90 nm, grande área superficial (740 m2 /g), repleta de poros distribuídos em um arranjo não completamente ordenado ao longo da partícula. Dispersões aquosas foram analisadas por medidas de espalhamento dinâmico de luz e de potencial Zeta, que indicaram polidispesividade e nanopartículas com carga superficial positiva variando entre 12,5 e 29,5 mV. A capacidade de interação com pDNA foi comprovada através de eletroforese em gel de agarose, tendo as NPSM funcionalizadas com 2 e 3 grupos amino maior eficiência de complexação. A avaliação da citotoxicidade das NPSM-NxH2 e dos complexos foi realizada pelo ensaio de MTT usando células NIH3T3 e HeLa, respectivamente, e indicou uma viabilidade de cerca de 80% para as células NIH3T3 incubadas com as nanopartículas e ao redor de 50% para as células HeLa incubadas com os complexos. Os complexos pDNA:NPSMNxH2 foram capazes de transfectar células HEK293T e HeLa, mas não células NIH3T3 empregando condições experimentais similares. A citometria de fluxo, indicou taxas de transfecção em células HeLa de 5,7 ± 1,8 %, 3,8 ± 1,3 % e 2,3 ± 1,2 % para as NPSM modificadas com os grupos NH2, NNH2 e NNNH2, respectivamente, taxas essas que foram inferiores a de 18,0 ± 9,7 % conseguida com o controle positivo, Lipofectamina 2000. NPSM com poros carregados com cloroquina, um agente endossomolítico, foram utilizadas visando aumentar a eficiência de transfecção. No entanto, a taxa de transfecção continuou baixa (1,9 ± 1 %), indicando que o aprisionamento endossomal parece não ter sido a etapa limitante do processo de transfecção deste sistema de entrega.