Estudo da acetilação na regulação da enzima glicolítica aldolase de Trypanosoma brucei

• Autor(a) principal: Leite, Ariely Barbosa [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/61732
• topic: Trypanosoma brucei; Acetilação; Aldolase; Glicólise; Acetylation; Mass spectrometry; Glycolysis; Aldolase

Modificações pós-traducionais reversíveis em proteínas são um meio relativamente rápido e econômico para que as células respondam a mudanças ambientais como temperatura e disponibilidade de nutrientes. A acetilação é uma dessas modificações pós-traducionais e ocorre através da transferência de um grupamento acetil do Acetil-CoA para cadeia Nε-amino dos resíduos de lisina, eliminando a carga positiva desse aminoácido. Recentemente, nosso laboratório descreveu o acetiloma das formas procíclicas e sanguíneas do parasito protozoário causador da Tripanossomíase Africana, Trypanosoma brucei, e verificamos que o perfil de acetilação das duas formas é muito distinto. Uma das diferenças observadas foi para as enzimas da via glicolítica, onde níveis maiores de acetilação foram detectados na forma procíclica, que utiliza principalmente fosforilação oxidativa para obtenção de energia, do que na forma sanguínea, cuja principal fonte produtora de energia é através da glicólise. Esses dados sugeriam que a acetilação poderia atuar na regulação da atividade dessas enzimas da via glicolítica em T. brucei, como já verificado para aldolase e glicerol-3-fosfato desidrogenase, em mamíferos. Assim, neste trabalho buscamos investigar o papel da acetilação na regulação da atividade da fructose 1,6-bisfosfato aldolase de T. brucei. Inicialmente, avaliamos o efeito da glicose na regulação dos níveis de acetilação proteica das proteínas totais, mitocôndriais e glicossomais, e verificamos alterações dependendo da disponibilidade ou não de glicose. Em seguida, utilizando extratos totais de procíclicos cultivados na presença ou ausência de glicose dosamos a atividade da aldolase, e detectamos redução significativa da atividade dos extratos de parasitas cultivados na ausência de glicose. A atividade aumenta quando submetemos previamente os extratos a desacetilação in vitro. Uma redução de mais de 50% é observada nos extratos proteicos obtidos de parasitas crescidos em meio contendo glicose após acetilação in vitro. Estes dados foram reforçados através de ensaios de imunoprecipitação de proteínas que mostram um aumento na acetilação da aldolase de procíclicos cultivados na ausência de glicose, comparado com parasitas cultivados na presença de glicose. Através de mutações sítio-dirigidas demonstramos que acetilação na lisina 157 (K157) é capaz de extinguir completamente a atividade in vitro da aldolase do parasita. Além disso, através de análises in silico, de docking e de dinâmica molecular demonstramos que acetilação na K157 afeta o perfil eletrostático do sítio catalítico da enzima, a maneira como o substrato interage com a enzima e afeta a estrutura do sítio catalítico, fazendo com que ele assuma um estado de volume reduzido. Em conjunto, esses dados demonstraram pela primeira vez o papel da acetilação na regulação da atividade de enzimas da via glicolítica de T. brucei, abrindo a possibilidade de explorar o amplo espectro regulatório que esta modificação pós-traducional pode ter neste parasita.