Perfil transcricional ao longo do locus do Transcrito Específico do X inativo (XIST) na placenta de bovinos

• Autor(a) principal: Castro, Paloma Soares de
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFU
• Texto Completo: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/30952; http://doi.org/10.14393/ufu.di.2020.727
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA ANIMAL; Inativação do cromossomo X; RNAs não codificantes; XIST; Transcrição sense; Transcrição antisense; X chromosome inactivation; non-coding RNA; XIST; Antisense transcription; Sense transcription; Genética

A inativação do cromossomo X (ICX) ocorre como forma de compensar o desequilíbrio entre os sexos homo e heterogaméticos em relação à expressão gênica. Em camundongos está estabelecido que o RNA longo não-codante (lncRNA) Transcrito Específico do X Inativo (XIST) é essencial para o início do processo da ICX. O transcrito antisense mais conhecido no locus XIST de camundongos é o transcrito TSIX, um modulador negativo para XIST. No entanto, em bovinos esses eventos ainda não estão totalmente estabelecidos. Com isso, o objetivo deste estudo foi caracterizar os padrões de transcrição fita-específica ao longo do locus XIST na placenta fetal de bovinos. O RNA total foi isolado a partir de amostras de cotilédones fetais de fêmea e macho utilizando o Kit de Purificação PureLinkTM RNA Mini (Ambion, Austin,TX, USA). Para detectar a transcrição fita-específica, o cDNA foi sintetizado usando primers forward e reverse específicos para duas regiões do éxon 1, para o éxon 4 e para o éxon 6 do gene XIST usando o GoScriptTM Reverse Transcription System (Promega). Como controle positivo, foi utilizado cDNA sintetizado usando Oligo(dT) e random primers. Como controle negativo, foi realizado um cDNA utilizando Oligo(dT) e random primers na ausência da enzima transcriptase reversa. A análise da PCR em tempo real fita-específica (SS-RT-PCR) foi realizada em um Sistema de PCR Fast Realtime 7500 (Applied Biosystems) usando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e os mesmos pares de primers que foram usados para a síntese do cDNA. Cada amostra de cDNA (n=10) foi amplificada e analisada em duplicata e interpretada qualitativamente, como presença ou ausência de expressão. Foram identificadas as três isoformas de XIST (X1, X2 e X3), porém somente a isoforma X2 abrange todos os primers. A especificidade de cada amplicon foi confirmada pelo tamanho em gel de agarose (éxon 1 RepA- 139bp, éxon 1 bXIST - 172bp, éxon 4 TSIXM - 96pb e éxon 6 TSIXU - 159pb), pela análise da curva de melting e sequenciamento. Foi detectada transcrição sense ao longo de todo o locus XIST (éxons 1, 4 e 6) para os amplicons provenientes dos cotilédones fetais de macho e fêmea e transcrição antisense somente no éxon 1 (RepA e bXIST) derivado de cotilédone fetal de fêmea. Possivelmente os transcritos sense sejam o lncRNA XIST e que o transcrito antisense expresso no éxon 1 não seja o TSIX, mas sim o homólogo de XistAR ou outros RNAs ainda não caracterizados. Os resultados mostram a importância da caracterização como auxílio para compreensão da ICX em bovinos. Além disso, apresenta a relevância de se levar em conta a possibilidade de expressão de transcritos antisense quando se propõe a realizar estudos de expressão gênica, especialmente em locus de ncRNA, onde a transcrição das duas cadeias de DNA é mais frequente.