Physiological and biochemical events related to stallion sperm capacitation in in vitro conditions

• Autor(a) principal: Maitan, Paula Piccolo
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: eng
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: https://locus.ufv.br//handle/123456789/28591
• topic: Espermatozoides; Garanhões; Capacitação; Adenilato ciclases; Reprodução Animal

Apenas dois potros foram nascidos de FIV (fertilização in vitro) convencional em equinos, ambos no início dos anos 90. O principal motivo do insucesso da técnica é direcionado ao espermatozoide do garanhão, que não é capaz de penetrar a zona pelúcida e fertilizar o oócito provavelmente devido a sua incompleta ativação (capacitação) em condições in vitro. Capacitação pode ser definida como o conjunto de mudanças físicas e biológicas que acontecem no espermatozoide o tornando apto a fertilizar o oócito em condições in vivo ou in vitro. Para que esse processo ocorra, o espermatozoide deve estar submetido a um ambiente que contenha bicarbonato (HCO 3- ), cálcio (Ca 2+ ) e albumina. Essas substâncias causarão mudanças nas concentrações de adenosina monofosfato cíclico (AMPc), pH e Ca 2+ intracelular, além alteração no potencial de membrana causando reorganização da membrana plasmática e depleção do colesterol, levando ao espermatozoide à reação acrossomal e fertilização do oócito. Infelizmente, nos equinos várias etapas da capacitação ainda não estão bem elucidadas. O objetivo desse trabalho foi demonstrar, por meio do uso de citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, crio-eletromicroscopia e imunohistoquímica, algumas etapas da capacitação espermática de garanhões na presença de moléculas que podem estimular esse processo, além de compreender qual adenilato ciclase (solúvel ou transmembrana) está envolvida em algumas das etapas desse evento. O uso da probe Annexina-V em condições capacitantes demonstrou a ocorrência da exposição da fosfatidilserina (PS) em espermatozoides de garanhão durante o processo de capacitação, porém em uma pequena porcentagem da população (p≤0,05). Além disso, o uso de cafeína e dibutiril-AMPc indicam a relevância da via sAC/pkA para esse processo (p≤0,05). A observação de três diferentes padrões de fluorescência da Annexina-V no espermatozoide viável de garanhão sugere etapas sequenciais na remodelação da membrana plasmática. Em relação aos efeitos na fluidez de membrana e reação acrossomal induzida, diferentes concentrações de Ca 2+ não interferiram na população espermática viva, merocianina e FITC-PNA 647 positiva (p≥0,05). O cálcio deve estar presente no meio capacitante uma vez que, na presença de seu quelante EGTA, essas etapas da capacitação foram bloqueadas. Porém o cálcio não deve estar obrigatoriamente presente em elevadas concentrações para iniciar a capacitação em espermatozoides de garanhão como é necessário em outras espécies. Diferentes concentrações de progesterona (P4) e albumina sérica bovina (BSA) também não foram capazes de aumentar a fluidez de membrana ou induzir reação acrossomal nos espermatozoides de garanhão (p≥0,05). Em relação as adenilato ciclases, a adenilato ciclase solúvel (sAC) no espermatozoide de garanhão demonstrou ser responsável pelo aumento da fluidez de membrana na presença de bicarbonato. Esse resultado foi demonstrado pelo uso do LRE1, um inibidor específico da sAC que demonstrou não causar efeitos colaterais em outros eventos fisiológicos espermáticos como alteração do potencial mitocondrial (p≥0,05). A imunohistoquímica da sAC em espermatozoide de garanhões demonstrou diferente localização comparada à sAC de suínos. No espermatozoide de garanhão essa enzima está presente formando uma linha pontilhada como um cordão na parte distal do acrosoma enquanto no suíno essa enzima está presente na parte apical da região acrossomal e na porção inicial da peça intermediária. A ação da forskolina indicou que a adenilato ciclase transmembrana (tmAC) possivelmente está presente no espermatozoide de garanhão e pode desempenhar um papel na reação acrossomal. Contudo, o fato da necessidade de uma alta concentração (500 µM) necessária para demonstrar seu efeito comparada a outras espécies indica que mais estudos como o uso de inibidores específicos (como o ddAdo) ou imunohistoquímica da tmAC (AC1-9) devem ser realizados no intuito de corroborar e validar os resultados encontrados. Em conclusão os resultados obtidos no presente trabalho elucidam diversos questionamentos na capacitação espermática de garanhões como exposição da PS, papel de diferentes concentrações Ca 2+ , P4 e BSA nesse evento além do papel de diferentes adenilato ciclases em alguns estágios da capacitação demonstrando que a capacitação é um processo complexo que varia entre as espécies. Palavras-chave: Adenilato ciclases. Capacitação. Espermatozoide de garanhão. Reorganização de membrana.