Produção, purificação e caracterização de celulases e hemicelulases do fungo da podridão-branca Pycnoporus sanguineus PF-2

• Autor(a) principal: Rodrigues, Rosilene Souza
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://locus.ufv.br/handle/123456789/339
• topic: Biocombustíveis; Biomassas lignocelulósicas; Pycnoporus sanguineus; Chrysoporthe cubensis; Biofuels; Lignocellulosic biomass; Pycnoporus sanguineus; Chrysoporthe cubensis; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA

Neste trabalho, o processo de produção de celulases e hemicelulases pelo fungo da podridão-branca Pycnoporus sanguineus PF-2 visando a sua aplicação na sacarificação do bagaço de cana foi estudada. Inicialmente, o meio de cultura para a produção de celulases e xilanase foi otimizado a partir das metodologias Fatorial Fracionado 25-1 (resolução V) seguido por um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). Para a máxima produção de endoglicanase (16,42 U/mL), FPase (0,38 U/mL) e xilanase (111,03 U/mL), os valores ótimos para os fatores concentração de forrageira, concentração de peptona e concentração de ZnSO 4 foram 4 % (m/v), 2 % (m/v) e 12,5 mg/L, respectivamente. Já os valores ótimos para o tempo de cultivo foi 186,1 h para endoglicanase, 180 h para FPase e 185,1 h para xilanase. Para atividade celobiase, a máxima produção (0,35 U/mL) ocorreu quando os fatores concentração de forrageira, concentração de peptona e tempo de cultivo foram 4 % (m/v), 2 % (m/v) e 60 h. As atividades de endoglicanase, celobiase e xilanase produzidas apresentaram máximas atividades entre 55 e 65 °C e em pH entre 4,0 e 5,5. Endoglicanase e xilanase retiveram mais de 50 % de atividade residual após 13 h de incubação a 60 °C. O extrato bruto otimizado foi aplicado na sacarificação do bagaço de cana, convertendo 17,4 % da celulose em glicose após 76 h. Em sequência, a fim de se obter maiores rendimentos na hidrólise do bagaço de cana, o extrato enzimático de P. sanguineus, produzido em fermentação submersa (FS), e o extrato enzimático de C. cubensis, produzido em fermentação em estado sólido (FES), foram misturados em diferentes proporções e avaliados quanto à ocorrência de sinergismos entre as enzimas presentes nestes extratos. Os coquetéis produzidos a partir de uma simples mistura dos extratos enzimáticos destes fungos não apresentaram nenhum efeito sinérgico positivo. Contudo, quando esta mistura foi realizada de forma não convencional, ou seja, durante a extração enzimática das enzimas produzidas na FES, observou-se grandes efeitos sinérgicos sobre as atividades das enzimas FPase, exoglicanase, celobiase, β-glicosidase, xilanase, β- xilosidase e -arabinofuranosidase. Os aumentos obtidos nas atividades enzimáticas destas enzimas foram de 52,2 %, 9,2 %, 62 %, 26,5 %, 12,2 %, 56,2 % e 18,4 %, respectivamente. O coquetel produzido a partir desta mistura não convencional dos extratos enzimáticos de P. sanguineus e C. cubensis foi aplicado na sacarificação do bagaço de cana e altos rendimentos de conversão de glicana e xilana foram alcançados. Quando utilizou-se uma carga enzimática de 10 FPU/g, foram obtidos rendimentos de 85 % e 95% de conversão de glicana e xilana, respectivamente. Já quando uma carga de 5 FPU/g foi utilizada, os rendimentos foram de 68 % e 85 % para conversão de glicana e xilana, respectivamente. Por fim, um novo complexo celulásico, CMCase, produzido pelo fungo P. sanguineus, foi purificado e caracterizado cinético e bioquimicamente. O complexo CMCase purificado é composto por duas endoglicanases, sendo uma pertencente a família GH10 e outra com homologia parcial às proteínas TLs (Thaumatinas-like) e ainda sem classificação; além de duas celobiohidrolases, GH6 e GH7. A endoglicanase GH10 possui massa molecular de 35,9 kDa. A endoglicanase sem classificação e a celobiohidrolase GH6 possuem massas moleculares de 42 kDa, já a celobiohidrolase GH7 possui massa molecular de 52,7 kDa. O complexo CMCase foi bastante termoestável, com temperatura ótima de atividade a 70°C, e apresentando meia-vida de 57,2 h a 50°C. Além disso, apresentou altas atividades em uma ampla faixa de pH (3,5-5,5) e temperatura (50-75°C). Os valores de KM e Vmax foram de 45,72 mg/mL e 7 μmol/min, respectivamente. Foi verificado que os íons metálicos Fe3+, Ag3+, Hg2+ e Cu2+ e os reagentes SDS, furfural, HMF e ácido acético apresentam efeito inibitório sobre a atividade enzimática do complexo CMCase. Foi observado também que complexo CMCase possui maior especificidade pelo substrato barley-β-glicano e pelas hemiceluloses xilana birchwood e locust bean gum, apresentando também altas atividades sobre estes substrato. Além disso, o complexo CMCase foi aplicado na hidrólise do CMC e verificou-se uma grande formação de glicose e celobiose com o decorrer do tempo, sugerindo uma clivagem assimétrica dos oligossacarídeos maiores produzidos, ou seja, o complexo CMCase cliva preferencialmente em regiões mais externas dos oligassacarídeos maiores.