Adaptação das metodologias de PRINS, micromanipulação e DOP-PCR para construção de sonda da região sub-centromérica do cromossomo-X

• Autor(a) principal: Passamani, Paulo Zanchetta
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://locus.ufv.br/handle/123456789/4787
• topic: Citogenética molecular; FISH; DOP-PCR; PRINS; Molecular cytogenetics; FISH; DOP-PCR; PRINS; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS

Com o advento da hibridização in situ fluorescente, a citogenética foi introduzida na era molecular, com avanços metodológicos que possibilitaram a investigação em vários níveis da ciência dos cromossomos. Destaca-se entre esses avanços a identificação de pares de cromossomos homólogos de forma inequívoca, a localização de sequências específicas, a prospecção direta de anormalidades cromossômicas, além de proporcionar informações de alta-resolução sobre a estrutura e organização dos cromossomos. Dentro das estratégias da citogenética molecular, as técnicas de microdissecção e de DOP-PCR têm sido muito utilizadas na construção de sondas cromossomo-específicas. Entretanto, a ausência de protocolos bem estabelecidos e reprodutíveis, além da necessidade de captura por micromanipulação de um número relativamente grande de cromossomos, essa técnica tem sido limitada quanto à sua aplicação mais ampla. O presente trabalho teve como objetivo padronizar uma metodologia para construção de sondas cromossomo-específicas, associando as técnicas de micromanipulação e DOP-PCR. Culturas de linfócitos humanos foram realizadas para a obtenção de lâminas contendo metáfases, tanto de origem masculina quanto feminina. A reação de amplificação in situ (PRINS) foi realizada sobre uma lâmina contendo metáfases, aplicando uma mistura de 50 μl de reação, contendo 1,0 U de Platinun® Taq DNA Polymerase High Fidelity, tampão de reação da enzima, 2 mM de MgSO4, 200 μM de dNTPs e 4 μM de primer. Em seguida, dez fragmentos de cromossomos X foram microdissectados utilizando microagulhas acopladas a um microscópio de contraste de fase e transferidos para um tubo de 0,2mL contendo proteinase K, de onde seguiu para a desproteinização a 37 ºC por 24 horas. O material foi amplificado por DOP-PCR em 15 μl de reação, e marcado com Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP. A sonda foi desnaturada por 10 minutos a 99 ºC em 35 μL de uma mistura de hibridização contendo: 50 % Formamida, 2X SSC, 10 % Dextran Sulfato, 1 μg de Cot-1 e 200 ng da sonda marcada. Essa mistura foi aplicada na lâmina, que foi desnatura a 75 ºC por 8 minutos e depois foi submetida à hibridização a 37 ºC por 20 horas. Após a hibridização, foram realizadas as lavagens de estringência, contra-coloração com DAPI, e visualização do material em microscópio de fluorescência acoplado a um sistema de captura de imagens. Uma sonda específica para a região subcentromérica do cromossomo X foi obtida, apresentando uma marcação em metáfases de indivíduos masculinos e duas marcações em metáfases de indivíduos femininos, além de um ou dois sinais fluorescentes nos núcleos interfásicos.