O papel dual de AtbZIP60 e AtbZIP9 como moduladores das vias de estresse no retículo endoplasmático e estresse osmótico

• Autor(a) principal: Simoni, Eduardo Bassi
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: https://locus.ufv.br//handle/123456789/28663
• topic: Transdução de sinal celular; Fatores de transcrição; Stress (Fisiologia); Plantas; Biologia Molecular

O desenvolvimento e adaptação de plantas a condições ambientais é altamente correlacionado com a regulação da expressão gênica. Sobre condições de estresse, eventos celulares são desencadeados no intuito de restabelecer a homeostase celular. Da mesma forma, a via de resposta a proteínas mal dobradas (UPR) é caracterizada como sendo um mecanismo celular citoprotetor essencial a respostas aos estresses bióticos e abióticos, os quais são capazes de alterar a homeostase do retículo endoplasmático (RE). Mediante qualquer perturbação no RE que cause acumulo de proteínas mal dobradas em sua porção luminal, os receptores acoplados ao RE são ativados e desencadeiam a sinalização da via UPR. Uma vez ativada, essa cascata de sinalização promove o aumento da expressão de genes relacionados com o dobramento e a degradação de proteínas. Entretanto, em condições de estresse prolongado, a resposta de defesa não é capaz de restaurar o equilíbrio, dessa forma, vias de morte celular programada (PCD) são ativadas. A via NRP/DCD (Asparagine- Rich Protein/Development and Cell Death), uma via de morte celular programada mediada por proteínas ricas em asparagina, é responsiva e conecta sinais de estresse no RE e estresse osmótico. Embora esta via seja conservada entre as espécies, o mecanismo molecular não é totalmente caracterizado, assim como seus componentes. Além de seu papel essencial na via UPR, a chaperona molecular BiP modula negativamente a via de morte celular mediada por proteínas NRP/DCD. Com intuito de elucidar o mecanismo molecular da referida via de resposta a estresses e seus moduladores, AtbZIP60 e AtbZIP9 foram os alvos de estudos deste trabalho. Bem caracterizada como uma proteína da via UPR, bZIP60 apresenta duas isoformas que, consequentemente, podem apresentar respostas alternativas em condições de estresse distintas. Ao contrário de bZIP60, bZIP9 é pouco caracterizado em relação a sua função molecular e suas interações na célula com outras moléculas. Portanto, nós investigamos como bZIP60 e bZIP9 são modulados sobre condições de estresse osmótico e no RE, assim como o papel desses fatores de transcrição (FT) na via de morte celular programada mediada por proteínas NRP/DCD. Nós avaliamos como esses genes respondem a tratamentos com PEG (polietilenoglicol) e TUN (tunicamicina) em plântulas Col-0 (Columbia) de Arabidopsis. Ambos os genes apresentaram um aumento de expressão em resposta a ambos os estresses. Os FT bZIP usualmente atuam como dímeros, homodímeros ou heterodímeros, dessa forma, nós avaliamos se bZIP9 interage com bZIP60 ou se é capaz de formar homodímero. Não foi possível realizar a abordagem de duplo-híbrido em leveduras devido a capacidade de auto-ativação de ambos os FT. Interessantemente, através do ensaio BiFC (complementação bimolecular de fluorescência) nós identificamos que bZIP9 pode formar homodímeros assim como interagir com bZIP60, sendo que, a interação foi intensificada quando as plantas foram tratadas com o indutor TUN. Devido a interação dos FT e o aumento de suas expressões em condições de estresse no RE e osmótico, nos perguntamos se essa expressão elevada em Arabidopsis poderia promover tolerância a estresse osmótico e no RE. Nós observamos uma resposta dual de bZIP9 e bZIP60 perante ambos os estresses. Linhagens superexpressando bZIP9 e bZIP60 foram mais tolerantes a condições de seca quando comparadas com Col-0 ou com a linhagem nocaute de bZIP60 (bzip60). Essas linhagens superexpressando os FT apresentaram fenótipo turgido, alto conteúdo relativo de água durante o estresse, assim como uma maior taxa de sobrevivência após a reidratação. Apesar disso, sobre condições prolongadas de estresse no RE, as mesmas linhagens apresentaram um fenótipo de clorose mais proeminente quando comparados com Col- 0 e bzip60. Além disso, nós avaliamos a influência dos FT na via de morte celular mediada por proteínas NRP desencadeada por estresse no RE. Linhagens superexpressando bZIP9 e bZIP60, Col-0 e bzip60 foram induzidas com TUN. A linhagem bzip60 não mostrou indução de NPR1, enquanto o gene NRP2 foi reprimido nessa condição. Entretanto, as linhagens superexpressando os FT mostraram um aumento na expressão de NRP1 quando comparado com Col-0 e bzip60. Nós também avaliamos a influência da superexpressão de NRP/DCD na expressão gênica de bZIP9 e bZIP60. Transformamos protoplastos com vetores carreando os genes NRPs e avaliamos a resposta após 8h de indução. A superexpressão de NRP1 e NRP2 estimulou positivamente a expressão dos FT. De acordo com tudo que foi mencionado, os resultados mostraram que bZIP9 e bZIP60 estão envolvidos em respostas a estresse osmótico e no RE, assim como modulam os genes NRP/DCD e são induzidos por eles. Experimentos adicionais são necessários para a compreensão do mecanismo desses FT em respostas a estresses.