The role of NAD+ compartmentation and dynamics in Arabidopsis thaliana

• Main Author: Araujo, Elias Feitosa
• Publication Date: 2020
• Format: Doctoral thesis
• Language: eng
• Source: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Download full: https://locus.ufv.br//handle/123456789/29064
• topic: Arabidopsis thaliana - Metabolismo; Arabidopsis thaliana - Desenvolvimento; NAD (Coenzima); Fisiologia Vegetal

Nicotinamide adenina dinucletídeo (NAD+) é uma coenzima fundamental para a regulação do metabolismo central e do estado redox celular. Plantas produzem NAD+ através das vias de novo e salvamento. Apesar de começarem em diferentes compartimentos, de novo nos cloroplastos e salvamento no citosol ambas as vias sintetizam NAD+ como produto final no citosol. Desta forma, o NAD+ precisa ser importado pelas organelas para exercer suas funções no interior das mesmas. Em Arabidopsis três genes foram identificados como transportadores de NAD+ sendo dois localizados na membrana interna da mitocôndria NDT1 (At2g4790) e NDT2 (At1g25380) e um na membrana do peroxissomo PXN (At2g39970). A caracterização funcional dos genes NDT1, NDT2 e PXN revelou a importância a importância desses genes para a produção e qualidade de sementes, estabelecimento de plântulas, fotossíntese, metabolismo e regulação do número de estômatos e condutância estomática. Para aumentar nosso conhecimento sobre a importância das dinâmicas de NAD+, utilizamos mutantes para o transporte de NAD+ e nos focamos em compreender: (1) como a distribuição de NAD+ afeta o desenvolvimento estomático em cotilédones, (2) a interação entre transporte de NAD+ e altas concentrações de gás carbônico e (3) dinâmicas de NAD+ in vivo em diferentes situações ambientais. Os resultados indicam que o NAD+ regula negativamente o desenvolvimento estomático em cotilédones de Arabidopsis. Plântulas com reduzida expressão dos transportadores de NAD+ mitocondriais (NDT1 e NDT2) e do peroxissomo (PXN) apresentaram reduzidos números de células formadoras de estômatos e densidade estomática. Além disso, cotilédones tratados com NAD+ de forma exógena e cotilédones de plantas com reduzida capacidade de mobilização de NAD+ também exibiram menor densidade estomática. O impedimento de transporte de NAD+ e o tratamento exógeno com NAD+ foram associados com a indução de genes responsivos ao hormônio ABA. Adicionalmente, o tratamento de NAD+ em mutantes para a síntese (aba-2) e sinalização (ost1) de ABA não impactou o número de estômatos enquanto o uso de um inibidor da biossíntese de ABA recuperou o fenótipo de estômatos dos mutantes para o transporte de NAD+ . Ademais, a mensuração in vivo das dinâmicas de ABA em plântulas do sensor de ABA (ABA-specific optogenetic repórter – ABAleon2.1) tratadas com NAD+ mostraram aumentos nos níveis de ABA, sugerindo que o NAD+ impacta o número estomático através da síntese e sinalização de ABA. Os resultados demonstraram que a homeostase intracelular de NAD+ é essencial para o correto desenvolvimento estomático e fornece uma ligação entre o metabolismo central e a plasticidade do desenvolvimento. Posteriormente crescemos os mutantes para o transporte de NAD+ em elevadas concentrações de CO2 e em geral os resultados mostraram que as plantas mutantes apresentaram menor biomassa e número de folhas que o controle em altas concentrações de CO2 . Adicionalmente, plantas mutantes acumularam intermediários da fotorrespiração, tais como glutamato e glicina em alto CO2 . Além disso, plantas mutantes produziram muito menos sementes que plantas WT em resposta ao CO2 , demonstrando que a compartimentalização do NAD+ é fundamental durante a fase reprodutiva em condição ambiente e de alto CO2 . Com o objetivo de estudar as dinâmicas de NAD+ transformamos plantas controle e plantas com reduzida expressão do gene NDT1 com o sensor de NAD+ chamado Peredox-mCherry que permite a mensuração da dinâmica de NADH/NAD+ no citosol in vivo. O citosol das plantas mutantes ndt1 apresentaram maiores níveis de NADH/NAD+ comparado com o citosol de plantas controle. Adicionalmente, aumentos nos níveis de NADH/NAD+ em folhas de ndt1 foram observados após o tratamento destas com açúcares e intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Surpreendentemente, os tratamentos com luz, inibidores da cadeia de transporte mitocondrial e indução de estresse por oxigênio não apresentaram diferenças significativas nos teores de NADH/NAD+ entre mutantes e plantas controle. Os resultados apresentam evidência do desbalanço de NAD+ entre as organelas em plantas mutantes e mostra ainda como essa técnica é valiosa para estudar as dinâmicas de NADH in vivo. Coletivamente, os dados apresentados mostram que não apenas o metabolismo do NAD+ é fundamental para regular processos biológicos essenciais, mas também sua distribuição entre organelas. Além disso, este estudo propõem uma ligação direta entre o metabolismo central e processos iniciais de desenvolvimento como o desenvolvimento estomático. Palavras-chave: Nicotinamida adenina dinucleotídeo. Transporte de NAD+ . Metabolismo. Desenvolvimento.