Caracterização molecular do gene da β-tubulina em Phakopsora pachyrhizi

• Autor(a) principal: Maciel, Talles Eduardo Ferreira
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2406
• topic: Caracterização molecular; β-tubulina; Phakopsora pachyrhizi; Molecular characterization; β-tubulin; Phakopsora pachyrhizi; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR

Neste trabalho, foi realizada a caracterização molecular do gene da β-tubulina de Phakopsora pachyrhizi e da proteína codificada por este gene. Uredósporos foram coletados em sete municípios brasileiros. O DNA genômico foi extraído e o gene da β-tubulina amplificado pela técnica de PCR, por meio de cinco combinações de primers específicos de modo a cobrir toda a região desejada. Os fragmentos obtidos foram purificados e sequenciados. As sequências foram alinhadas e comparadas entre si e com sequências obtidas no GenBank. O gene da β-tubulina de P. pachyrhizi apresentou 2815 pares de bases, sendo constituído de nove éxons e oito íntrons. Sua fase aberta de leitura (ORF) apresentou 1341 pares de bases. Verificou-se que 452 pares de bases são correspondentes à região promotora, enquanto 234 pares de bases pertencem à extremidade 3 não traduzida. A região promotora apresentou os sinais típicos envolvidos com o início da transcrição, sendo três possíveis sequências TATA box e cinco possíveis sequências CAAT box. Um domínio de 30 nucleotídeos, constituído por citosina e timina, está contido na região promotora entre os pares de bases -205 e -175 upstream ao códon de inicio da tradução. Sítios envolvidos no mecanismo de splicing estão presentes, flanqueando os oito íntrons, sendo o sítio GT(A/G)(N)GT encontrado na extremidade 5 do íntron e o sítio (C/T)AG na extremidade 3 . A sequência consenso AATAAA, que desempenha papel importante no processo de poliadenilação do mRNA precursor, foi encontrada a 44 pares de bases downstream do códon de terminação TAG. A ORF encontrada para este gene codifica uma proteína constituída por 446 aminoácidos, a qual apresenta elevada identidade (acima de 89%) com β-tubulina de outras espécies de fungos relacionados. Ao comparar a sequência de aminoácidos predita para β-tubulina, verificou-se que esta proteína possui quatro domínios conservados, sendo eles: domínio de ligação a nucleotídeos, domínio de ligação ao taxol, domínio de interface alfa/beta e domínio de interface beta/alfa. Análises filogenéticas, com base no alinhamento do gene da β-tubulina, proporcionaram a alocação de P. pachyrhizi junto aos demais fungos causadores de ferrugens. Comparação dos íntrons do gene da β-tubulina de P. pachyrhizi com íntrons de Melampsora lini e Uromyces fabae, sendo as duas últimas as únicas espécies de fungos causadores de ferrugens com o gene da β-tubulina completamente sequenciado até o momento, mostrou conservação no número e posição dos íntrons. Entretanto, as sequências correspondentes a cada um dos íntrons mostraram baixa identidade (aproximadamente 30%).