Effects of antioxidants ascorbic acid and dithiothreitol, or an inhibitor of caspase-3 during cryopreservation of in vitro produced bovine embryos

• Autor(a) principal: Carrascal Triana, Erly Luisana
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: eng
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/9351
• topic: Bovino - Reprodução; Embrião - Criopreservação; Antioxidantes; Ciências Agrárias; Zootecnia

Os experimentos descritos no presente trabalho foram realizados com o objetivo geral de avaliar se a adição dos antioxidantes ácido ascórbico (AA) e ditiotreitol (DTT), ou o inibidor da caspase-3 (z-DEVD-fmk), durante a criopreservação podem melhorar o criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados cinco experimentos representados assim: experimento 1, 2 e 3 no capitulo 1 e, experimento 4 e 5 no capitulo 2. Para todos os experimentos, os complexos cumulus- oócitos foram obtidos a partir de ovários de vacas de abatedouros. Os oócitos foram maturados, fertilizados e cultivados in vitro até o dia 7. Blastocistos e blastocistos expandidos foram aleatoriamente submetidos ao congelamento com taxa controlada seguindo o equilíbrio de 10 min em meio de congelamento (Hepes-TALP acrescido de 1,5 M de etilenoglicol e 0,1 M de sacarose) com os tratamentos tal como descrito abaixo. No experimento 1, os embriões foram equilibrados no meio de congelamento contendo 0,0; 0,1; 0,3 ou 0,5 mM de AA. Os embriões em palhetas foram então colocados numa máquina de congelamento programável em -6,0 °C a -32 °C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 °C). Em seguida, os embriões foram descongelados e cultivados durante 72 h em meio SOF-BE1 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino a 38,5 °C numa atmosfera umidificada de 5% de CO 2, 5% O2 e 90% N2. Os embriões tratados com 0,1 mM de AA apresentaram maiores taxa de re-expansão às 24, 48 e 72 h e na taxa de eclosão às 72 h em comparação com os embriões do controle (P<0,05), assim, essa concentração foi considerada como ótima para os seguintes experimentos. Para o experimento 2 e 3, os embriões foram criopreservados em meio de congelamento contendo ou não 0,1 mM de AA, em seguida foram descongeladas e cultivadas durante 24 h. As concentrações intracelulares de espécies reativas de oxigénio foram reduzidos (P<0,001) pelo antioxidante AA (30,3 ± 2,4) em comparação com o controle (49,3 ± 1,9). Não houve efeito sobre o número total de células de blastocisto (P>0,05). Contudo, o AA 0,1 mM reduziu (P<0,001) a percentagem de células apoptóticas e a fragmentação do DNA comparado ao grupo controle. Os experimentos 4 e 5 foram conduzidos para avaliar os efeitos do DTT ou z-DEVD-fmk durante a criopreservação. Blastocistos e blastocistos expandidos foram equilibrados em meio de congelamento contendo DTT (0, 50, 100 e 200 μM) ou z-DEVD-fmk (0, 50, 100 e 200 μ M). Os embriões em palhetas foram colocados numa máquina de congelamento programável em -6,0 °C a -32 °C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 °C). Os embriões foram descongelados e cultivados em seguida durante 72 h. A taxas de re-expansão e eclosão foram registradas às 24, 48 e 72 h. Não houve efeito (P>0,05) do tratamento com DTT ou z-DEVD-fmk nas taxas de re-expansão e eclosão às 24, 48 ou 72 h pós- descongelamento. Este é o primeiro trabalho que utiliza os antioxidantes AA e DTT ou o inibidor específico da apoptose z-DEVD-fmk no meio de criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. Em conclusão, a adição de AA (0,1 mM) no meio de congelamento lento melhora a crio-sobrevivência de embriões bovinos produzidos in vitro, reduz as concentrações intracelulares de espécies reativas de oxigénio e a fragmentação do DNA. Os tratamentos DTT e z-DEVD-fmk não apresentaram nenhum efeito sobre a sobrevivência dos embriões pós- descongelamento.