Clonagem e expressão in vitro da ORF AC5 do Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) e produção de anti-soro

• Autor(a) principal: Barros, Danielle Ribeiro de
• Data de Publicação: 2003
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/10116
• topic: Fitopatologia; Virologia; Biologia Molecular; Ciências Agrárias

O Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) é um begomovírus descrito como parte de um complexo viral causando mosaico dourado e deformação (rugosidade) foliar em tomateiro na região do Triângulo Mineiro, Minas Gerais. Os dois componentes genômicos encontram-se completamente sequenciados, e a análise das seqüências de nucleotídeos do DNA-A indicou a presença de uma ORF adicional denominada AC5, presente apenas em algumas espécies de begomovírus. Esta ORF está quase totalmente inserida na sequência do gene cp, porém em orientação inversa e em outra fase de leitura. A ORF AC5 do ToRMV tem o potencial de codificar uma proteína com aproximadamente 27 kDa. A função do produto potencial da ORF AC5 foi estudada apenas para o Watermelon chlorotic stunt virus (WmCSV), não sendo encontrado nenhum indício da expressão da ORF. Entretanto, a seqüência de aminoácidos da proteína potencialmente codificada pela ORF AC5 do ToRMV possui apenas 41% de identidade com a AC5 do WmCSV. É possível que a ORF AC5 do ToRMV seja expressa, e que a proteína desempenhe alguma função no ciclo de infecção viral. Este trabalho teve por objetivo a clonagem e a expressão in vitro da ORF AC5 do ToRMV e a producão de anti-soro específico. Oligonucleotídeos específicos foram utilizados para a amplificação da região codificadora da ORF AC5 via PCR. O fragmento amplificado foi clonado no vetor de expressão pRSET-C. Plasmídeos recombinantes foram utilizados para a expressão da proteína AC5 em E. coli BL21::DE3. A proteína foi purificada a partir das células de E. coli e utilizada para a produção de anti-soro policlonal em coelhos. A especificidade do anti-soro policlonal obtido foi confirmada por Western blot. Esse anti-soro poderá ser utilizado em ensaios de imunolocalização da proteína AC5 em tecidos infectados pelo ToRMV.