Produção, purificação e identificação de enzimas extracelulares de fungos nematófagos e suas atividades nematicidas

• Autor(a) principal: Soares, Filippe Elias de Freitas
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/6680
• topic: Fungos nematófagos; Enzimas; Fungos - Controle biológico; Bioquímica Agrícola

O controle biológico é uma das possíveis aplicações biotecnológicas de enzimas fúngicas. Este tipo de controle se destaca por ser uma alternativa “limpa”, sem o uso de produtos químicos que possam gerar possíveis resíduos. Nesse contexto, fungos nematófagos produzem enzimas extracelulares envolvidas em diversas etapas da infecção, como liberação de nutrientes para o crescimento do microrganismo, penetração da cutícula pela degradação proteica e digestão do tecido hospedeiro. O mecanismo molecular da ação patogênica de fungos contra nematoides não é completamente conhecido. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a produção, purificar e caracterizar enzimas extracelulares produzidas por fungos nematófagos, bem como avaliar sua capacidade nematicida. Micélios obtidos da transferência de discos de cultura de três isolados de fungos nematófagos (Monacrosporium thaumasium (NF34), M. sinense (SF53) e Pochonia chlamydosporia (VC4)) mantidos em corn-meal-ágar 2% (CMA 2%) e transferidos para frascos contendo meio de cultura que teve sua composição otimizada para a produção de protease e quitinase. Em seguida, as enzimas foram purificadas e caracterizadas em relação ao pH e temperatura. Por fim, foi demonstrada a atividade nematicida dos extratos brutos e das enzimas purificadas sobre larvas de nematoides. Duas varíaveis (pH e tempo de incubação), apresentaram um efeito significativo (p<0,05) sobre a produção de protease do fungo nematófago Monacrosporium sinense (SF53). Além disso, este fungo produziu três diferentes proteases (Ms1, Ms2 e Ms3) com atividade nematicida sobre larvas de Panagrellus redivivus, sugerindo que essas proteases sejam produzidas como um complexo enzimático eficaz na destruição de larvas de primeiro estágio de Angiostrongylus vasorum. Em relação a M. thaumasium (NF34), foi observada atividade nematicida (p<0.01) de seus conídios e de seu extrato bruto proteolítico em coproculturas sobre larvas de primeiro estádio de A. vasorum. Os efeitos das variáveis (quitina, quitina coloidal, glicose, nitrato de sódio (NaNO 3 ), umidade) sobre a produção xiide quitinase em fermentação no estado sólido pelos isolados de Monacrosporium NF34 e SF53 foram analisados usando o planejamento estatístico Plackett-Burman. Para o isolado NF34, nos níveis avaliados, a presença de quitina e NaNO 3 nos meios de cultura foram significativas (p<0,05) para a produção de quitinase. Por outro lado, para o isolado SF53, nos níveis avaliados, apenas a presença de glicose foi significativa (p<0,05) para a produção de quitinase. Em relação a influência do pH na atividade enzimática, para M. thaumasium (NF34), o valor de pH com maior atividade obtida foi 5.5. Entretanto, para M. sinense (SF53), a maior atividade foi observada em pH 8. Além disso, observou-se que o isolado NF34 produziu duas quitinases distintas com a atividade nematicida sobre larvas de P. redivivus. Por fim, a atividade ovicida do fungo nematófago Pochonia chlamydosporia (VC4) e de suas proteases e quitinases foi avaliada sobre ovos de Dioctophyma renale. Houve diferença significativa (p <0,01) na destruição de ovos em relação ao grupo de controle, não se verificando diferença estatisticamente significativa (p> 0,01) entre as concentrações de P. chlamydosporia na destruição de ovos. No entanto, houve uma tendência de aumento da mortalidade com o aumento da concentração de P. chlamydosporia. As proteases e quitinases do isolado VC4, causaram uma redução de percentagem significativa (p <0,01) no número de ovos viáveis de D. renale, em relação ao controle, com os seguintes valores de redução: 27,8% (proteases), 29,4% (quitinases) e 43,4% (proteases + quitinases). Mais estudos devem ser conduzidos no sentido de otimizar as condições de produção de enzima e aplicação destas no combate de nematoides.