Análise molecular da família gênica SBP da soja: organização genômica e expressão tecido-específica e dependente de sacarose

• Autor(a) principal: Contim, Luis Antônio Serrão
• Data de Publicação: 2002
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/10314
• topic: Expressão gênica; Promotor; Tecido-especificidade; Soja; Genética vegetal; SBP; Ciências Agrárias

A proteína SBP (Sucrose Binding Protein) foi inicialmente identificada pela sua capacidade de se ligar a sacarose e parece estar envolvida na via de translocação de sacarose em plantas superiores. Nesta investigação, foram isolados de uma biblioteca genômica de soja, propagada em λZAPII, dois clones genômicos, que correspondem às formas alélicas do gene SBP2. O número de cópias gênicas da família SBP foi estimado por Southern blot e por FISH (Fluorescence in situ Hibridization), utilizando o cDNA SBP e o clone genômico SBP2 como sondas, em lâminas com núcleos interfásicos de soja. O padrão de hibridização demonstrou a existência de dois pares de genes homólogos, com razão de hibridização diferente, representando os dois genes distintos, SBP e SBP2. Para investigar a funcionalidade da sequência do promotor SBP2, aproximadamente 2,0 quilobases da região 5’ foram sequenciadas e fusionadas aos genes repórteres GUS (beta-glucuronidase) e GFP (Green Fluorescent Protein) e analisados em plantas de tabaco transgênicas. Os ensaios histoquímicos demonstraram que ambos os promotores exibem expressão tecido- específica. Estes resultados foram confirmados pela fluorescência tecido- específica da expressão de GFP. Consistente com seu envolvimento no transporte de sacarose a longa distância, os promotores SBP2 dirigiram a expressão dos genes repórteres com alta especificidade para o floema de todos os órgãos analisados, como meristema, caule, folha e raiz. Entretanto, altos níveis de expressão foram observados predominantemente no meristema e em folhas- dreno. Foi também demonstrado que o promotor SBP2 é regulado de modo dependente da forma e da concentração de açúcar disponível no meio de cultura de células de tabaco transgênico em suspensão. Deleções no promotor SBP2 foram feitas para a identificação de regiões contendo elementos regulatórios em cis. Ensaios histoquímicos com plantas transgênicas contendo as construções quiméricas com as deleções do promotor demonstraram que o padrão tecido-específico do gene SBP2 é coordenado pela interação entre elementos regulatórios positivos e negativos. A região contida entre as posições -2000 até -490 possui elementos positivos que potencializam a expressão no floema, uma vez que a deleção dessa região causou um decréscimo substancial na atividade do promotor. A deleção adicional do promotor até a posição -364 restaurou a atividade do promotor em todos os tecidos analisados. Como conseqüência, a atividade quantitativa de GUS foi muito superior àquela observada para o promotor intacto. Estes resultados indicam a presença de um elemento silenciador, na região delimitada pelas posições -489 a -364. Além disso, a região de -363 a -132 possui um elemento positivo, responsável pela expressão no meristema radicular, uma vez que a deleção deste fragmento silencia a expressão de GUS no meristema radicular. O padrão de expressão tecido- específico, das construções quiméricas das deleções do promotor, se correlaciona com a distribuição dos elementos DOF na seqüência do promotor, em associação com os elementos O2 e GCN4. Coletivamente, estes resultados mostram que o promotor SBP representa uma poderosa ferramenta biotecnológica útil para o direcionamento da expressão de genes alvos para o tecido vascular de plantas de soja e tabaco transgênicas.