Mobilome-associated resistome in the Pasteurellaceae family and characterization of small RNAs transported by extracellular vesicles produced by Actinobacillus pleuropneumoniae

• Autor(a) principal: Silva, Giarlã Cunha da
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: eng
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: https://locus.ufv.br//handle/123456789/31428; https://doi.org/10.47328/ufvbbt.2022.335
• topic: Suíno - Doenças; Pleuropneumonia; Marcadores genéticos; DNA; RNA; Pasteurellaceae; Actinobacillus pleuropneumoniae; Microbiologia Agrícola

A família Pasteurellaceae compreende diversas espécies de bactérias Gram- negativas, comensais ou patogênicas de hospedeiros humanos e animais. Alguns membros da família Pasteurellaceae são responsáveis por causar doenças de impacto econômico em animais de produção, como suínos. Neste setor, gasto expressivos estão associados ao uso de antimicrobianos para o tratamento de infecções causadas por espécies da família Pasteurellaceae, muitas vezes persistentes e multirresistentes a drogas. Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é um membro da família Pasteurellaceae e causa a pleuropneumonia suína, responsável por prejuízos econômicos importantes na suinocultura em escala global. A. pleuropneumoniae é um patógeno primário e apresenta diversos fatores de virulência como: cápsula, LPS, sideróforos para ferro e exotoxinas Apx. Além disso, são capazes de produzir vesículas extracelulares (BEVs – Bacterial Extracellular Vesicles), o que representa mais um fator de virulência associado, visto o envolvimento na disseminação de elementos genéticos móveis (EGMs) e genes de resistência a antimicrobianos (AMR) e habilidades inovadoras que potencializam a virulência de App. Assim, os objetivos deste trabalho foram: i. avaliar a representatividade de EGMs associados com AMR em membros da família Pasteurellaceae, incluindo App e ii. caracterizar as BEVs produzidas por App e seu conteúdo de ácidos nucleicos, com foco em RNA e virulência. A investigação do resistoma associado ao mobiloma em Pasteurellaceae foi realizada a partir de análises in silico utilizando genomas completos disponíveis em bancos de dados com o intuito de identificar e caracterizar EGMs com ênfase na presença de genes de resistência associados a esses elementos. Através dessas análises foram encontrados 20 novos elementos integrativos e conjugativos (ICEs) e 23 novos profagos, além de ampliação da caracterização de elementos previamente descritos para a família. A partir dos resultados obtidos foi constatado que EGMs são responsáveis por carrear a maioria dos genes de resistência identificados nas bactérias da família Pasteurellaceae, podendo serem disseminados por diferentes mecanismos de transferência horizontal de genes (THG), como a vesidução (via BEVs). Assim, na segunda parte do trabalho, as BEVs de App foram obtidas, caracterizadas e o conteúdo de DNA e RNA investigado em diferentes de condições. As vesículas foram investigadas quanto ao tamanho, conteúdo proteico e lipídico, incluindo tipo de LPS, e conteúdo de ácidos nucleicos. A caracterização das BEVs revelou um perfil de proteínas semelhante ao encontrado na membrana externa de App, destacando o perfil dos lipídeos, não abordado até então para essa espécie. Os resultados revelaram que a condição de crescimento em anaerobiose afeta diversos aspectos da produção das BEVs, como quantidade e tamanho relativo. As BEVs apresentam como conteúdo de ácidos nucleicos, DNA e RNA, sendo o último mais abundante e por isso caracterizado neste trabalho. Análises de transcriptoma das BEVs produzidas por App revelou que essas vesículas transportam diversos tipos de RNAs, como tRNAs e small RNAs (sRNAs), sendo os últimos já descritos para App. Neste trabalho foram descritos 13 novos sRNAs para App, sendo 12 deles presentes em BEVs. Alguns sRNAs encontrados nas BEVs estão enriquecidos nas vesículas em relação às células e estão presentes na porção intravesicular, protegido da ação de nucleases. Dentre os sRNAs encontrados nas BEVs de App, o Rna01, previamente identificado por nosso grupo, foi selecionado para análises posteriores. Análises de alvos desse sRNA revelaram que ele está associado com a regulação de diversos genes que codificam proteínas de membrana, principalmente em resposta a condições de estresse, que foi confirmado através de análises de expressão quantitativa. Através de análises desenvolvidas com linhagens mutantes para Rna01, foi observado que a produção de BEVs também foi afetada, revelando a participação desse sRNA nesse processo em App. Esse trabalho traz uma completa caracterização de EGMs e AMR na família Pasteurellaceae e é também o primeiro trabalho a realizar uma caracterização completa das BEVs produzidas por App em diferentes condições, além de confirmar a presença e a funcionalidade de sRNAs em BEVs produzidas por App. Assim, várias informações inéditas e norteadoras de ações que visam o controle da pleuropneumonia suína. Palavras-chave: Pasteurellaceae. Actinobacillus pleuropneumoniae. Pleuropneumonia. Elementos genéticos móveis. Resistência antimicrobiana. Vesículas extracelulares bacterianas. Ácidos nucleicos. RNAs pequenos.