Obtenção de linhagens de Kluyveromyces lactis recombinantes produtoras do imunógeno SBm 7462 contra o carrapato Riphicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887)

• Autor(a) principal: Santos, Valdilene Canazart dos
• Data de Publicação: 2007
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/6576
• topic: Proteínas recombinantes; Kluyveromyces lactis; Carrapato; Peptídeos; Microbiologia Agrícola

O peptídeo denominado SBm 7462 (Sintético Boophilus microplus 7462) é uma vacina desenvolvida a partir da seqüência da proteína intestinal do carrapato B. microplus denominada Bm 86 apresentando ação imunogênica contra o mesmo. O carrapato B. microplus é um importante artrópode da medicina veterinária devido a perdas econômicas e problemas de saúde causados pelo referido parasita no gado da América Central e do Sul, bem como da Austrália. Este trabalho descreve a obtenção de linhagens de Kluyveromyces lactis recombinantes produtoras do referido peptídeo. Dois vetores de expressão integrativos foram construídos a partir do vetor pKLAC1: pKLAC1-seq1, contendo a seqüência 1 constituída por três cópias da seqüência de nucleotídeos que codifica para o SBm 7462 e o pKLAC1-seq4, contendo a seqüência 4 constituída por uma única cópia da seqüência de nucleotídeos que codifica o SBm 7462. As construções foram confirmadas por sequenciamento. O cassete de integração obtido pela clivagem do vetor com a enzima SacII foi utilizado na transformação da linhagem selvagem de K. lactis CBS2359. A integração dos cassetes por recombinação homóloga no locus LAC4 foi confirmada por PCR. A análise dos recombinantes de K. lactis por RT-PCR e a detecção do peptídeo, utilizando anticorpos monoclonais contra SBm 7462, comprovaram a transcrição e a expressão extracelular dos peptídeos. Os recombinantes foram cultivados em regime de batelada em YPGlicerol, alcançando uma concentração de biomassa de 10 g·L-1. A biomassa obtida foi transferida para o meio YNB com 4% (p/v) de lactose para induzir o promotor LAC4 e a síntese de SBm 7462 recombinante. Amostras foram analisadas quanto à concentração de proteína extracelular, por eletroforese em SDS-PAGE e detecção do imunógeno. A indução da síntese dos peptídeos foi testada sob duas condições: sem pulso adicional de lactose e com pulso de lactose, a cada 24 horas, durante 144 horas de indução. A concentração de proteínas extracelulares na segunda condição foi maior quando comparada com a condição sem pulso adicional de lactose. Atividade proteolítica não foi detectada no sobrenadante. O perfil eletroforético em SDS-PAGE revelando três bandas de aproximadamente 6, 10 e 21 kDa relacionadas ao peptídeo de interesse é discutido. A detecção do peptídeo vacinal com anticorpos monoclonais comprovou a presença extracelular do rSBm 7462.